【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种单细胞hi-c文库构建方法，属于基因测序。
技术介绍
1、染色质构象捕获(chromatin conformation capture)是一种分子生物学技术，用于研究染色体内部三维结构的空间组织。它在揭示基因组三维结构、理解基因调控机制、研究疾病发生机制以及推动药物研发等方面具有重要的意义。从2002年deker提出3c，随着研究水平的提升逐渐衍生出4c、5c、chia-pet、hi-c、capture hi-c等技术。这些方法都在不同程度上揭示了染色体内部的三维结构和相互作用，为研究基因调控、基因组稳定性和疾病发生提供了重要的工具。
2、传统的hi-c技术通常需要大量的细胞来获取足够的dna片段进行分析。由于不同细胞之间的基因组结构存在差异，因此单细胞hi-c技术应运而生。单细胞hi-c技术能够揭示不同细胞之间的基因组结构差异，为研究细胞类型间的基因组结构差异、细胞发育和疾病中的细胞异质性提供了突破性的机会。然而，由于起源于hi-c的单细胞hi-c技术和hi-c一样通常需要通过生物素调取重连片段，通常会存在建库周期长，成功率低的问题。并且，添加了生物素但未重连的片段会和重连片段一起被生物素调取，在之后的测序过程中被检测。未重连片段是与分析染色质的空间组织和结构无关的无效片段，被检测后会成为数据分析时的噪音数据，如dangling end(末端悬挂)等。因此，无效片段和噪音数据的比例一直是影响单细胞hi-c技术检测成本和检测质量的重要因素。此外，单细胞hi-c技术检测的是染色体经重连后的dna片段，
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术中存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种用时少、无效片段比例低且便于实验操作和分析的单细胞hi-c文库构建方法。
2、本专利技术为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过对单细胞hi-c技术进行改进，使用特殊的测序接头，特别是设置有测序引物序列的测序接头，将测序接头插入在重连片段内部，使得只有含重连片段的分子才会被测序仪检测到，获得无效片段占比更低的文库。通过本专利技术的文库构建方法能够降低文库对样本起始量和测序量的要求，同时还能省去生物素标记和调取重连片段的步骤，缩短建库时间从整体上降低了单细胞hi-c建库成本和检测成本，从而完成了本专利技术。通过采用本专利技术的单细胞hi-c文库构建方法，可以实现建库时间短，成本低，有效数据比例高的单细胞hi-c文库。
3、即，本专利技术包括，
4、1.一种单细胞hi-c文库构建方法，该方法包括以下步骤：
5、交联：将样本细胞内的dna与蛋白质交联，得到交联体；
6、酶切：酶切交联体中的dna，得到交联的dna片段；
7、加测序接头：将交联的dna片段加测序接头，得到加测序接头的dna片段，所述测序接头包括至少一段测序引物序列；
8、重连dna片段：将加测序接头的dna片段重新连接，得到交联的重连dna片段。
9、分离单细胞；
10、解交联：将交联的重连dna片段与蛋白质解交联，得到重连dna片段；
11、加文库接头，所述文库接头包括第一文库结构序列和第二文库结构序列；
12、文库扩增：采用带有第一文库结构序列的引物和带有第二文库结构序列的引物，对加文库接头的dna片段进行扩增，得到单细胞hi-c文库。
13、2.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述加测序接头的dna片段通过其带有的测序接头重新连接，所述重连dna片段内部包括两个测序接头。
14、3.根据权利要求1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述测序接头的长度为10-40bp，优选为10-30bp，更优选为15-25bp。
15、4.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述测序接头由两条dna单链组成，所述测序引物序列设置在3'端与所述交联的dna片段相连接的单链上，所述测序引物序列设置在其所在单链的3'端。
16、5.根据项4所述单细胞hi-c文库构建方法，所述设置测序引物序列的单链的5'端为突出的seq id no：1所示核苷酸序列，或，未设置测序引物序列的单链的3'端为突出的seq id no：1所示核苷酸序列，
17、seq id no：1：5'-n1……nmn'1……n'm-3'，其中，n为a、t、c、g脱氧核糖核苷酸中的任意一种，n1……nm与n'm……n'1为反向互补序列，m为1-4，优选的m为1-3，更优选的m为1-2，最优选的m为1。
18、6.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，其中，在酶切步骤后对交联的dna片段进行末端修复和加a处理。
19、7.根据项6所述单细胞hi-c文库构建方法，其中，设置测序引物序列的单链的3'端为突出的t。
20、8.根据项7所述单细胞hi-c文库构建方法，所述测序接头由seq id no：2和seq idno：3所示核苷酸序列组成，
21、seq id no：2：5'-cgtgtgctgtgactggagt-3'，
22、seq id no：3：5'-ctccagtcacagcaca-3'。
23、9.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，其中，所述文库接头还包括细胞条码。
24、10.根据项9所述单细胞hi-c文库构建方法，其中，所述细胞条码与所述第一文库结构序列直接相连。优选地，所述细胞条码设置在靠近重连dna片段的一端。
25、11.根据项9所述单细胞hi-c文库构建方法，所述细胞条码的长度为4-25bp，优选地6-10bp，更优选地8-16bp。
26、12.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，在解交联步骤后对重连dna片段进行进行片段化和加a处理。
27、13.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述文库接头由seq id no：4和seqid no：5所示核苷酸序列组成，
28、seq id no：4：5'-gtgaagatctcgtatgccgtcttctgcttg-3'，
29、seq id no：5：5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacac-nn nnnnnnnn-cttcact-3'。
30、14.根据项1所述单细胞hi-c文库构建方法，其中，所述加测序接头的步骤采用的试剂体系为：1x neb t4 dna ligase buffer，400,000u/ml neb t4 dna ligase，和0.1mm测序接头。
31、15.一种单细胞hi-c文库，其通过项1-14任一项所述单细胞hi-c文库构建方法获得，所述重连片段的内部包括两段测序引物序列，所述测序接头包括至少一段测序引物序列。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种单细胞Hi-C文库构建方法，该方法包括下述步骤
2.根据权利要求1所述单细胞Hi-C文库构建方法，所述加测序接头的DNA片段通过其添加的测序接头重新连接，所述重连DNA片段内部包括两个测序接头。
3.根据权利要求1所述单细胞Hi-C文库构建方法，所述测序接头的长度为10-40bp。
4.根据权利要求1所述单细胞Hi-C文库构建方法，所述测序接头由两条DNA单链组成，所述测序引物序列设置在3'端与所述交联的DNA片段相连接的单链上，所述测序引物序列设置在其所在单链的3'端。
5.根据根据权利要求4所述单细胞Hi-C文库构建方法，所述设置测序引物序列的单链的5'端为突出的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，或，未设置测序引物序列的单链的3'端为突出的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，SEQ ID NO：1：5'-N1…NmN'1…N'm-3'，
6.根据权利要求1所述单细胞Hi-C文库构建方法，其中，在酶切步骤后对交联的DNA片段进行末端修复和加A处理。
7.根据权利要求6所述单细胞Hi-C文库构建
8.根据权利要求1所述单细胞Hi-C文库构建方法，其中，所述文库接头包括细胞条码。
9.一种单细胞Hi-C文库，其通过权利要求1-8任一项所述单细胞Hi-C文库构建方法获得，所述重连片段的内部包括两段测序接头。
10.一种单细胞Hi-C文库的检测方法，其通过对权利要求9所述单细胞Hi-C文库进行测序，其是将重连片段内部的测序引物序列作为测序起始点。
...【技术特征摘要】
1.一种单细胞hi-c文库构建方法，该方法包括下述步骤
2.根据权利要求1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述加测序接头的dna片段通过其添加的测序接头重新连接，所述重连dna片段内部包括两个测序接头。
3.根据权利要求1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述测序接头的长度为10-40bp。
4.根据权利要求1所述单细胞hi-c文库构建方法，所述测序接头由两条dna单链组成，所述测序引物序列设置在3'端与所述交联的dna片段相连接的单链上，所述测序引物序列设置在其所在单链的3'端。
5.根据根据权利要求4所述单细胞hi-c文库构建方法，所述设置测序引物序列的单链的5'端为突出的seq id no：1所示核苷酸序列，或，未设置测序引物序列的单链的3'端为突出的seq...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋健，李小林，韦所苏，
申请(专利权)人：广西壮族自治区人民医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。