【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开的实施方案涉及用于边合成边测序(sbs)的双链多核苷酸的化学线性化的组合物和方法。序列表的参考本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表以于2022年12月14日创建的大小为18.0kb的以sequence_listing_illinc.692wo.xml命名的文件提供。序列表的电子格式的信息全文以引用方式并入本文。
技术介绍
1、各种核酸测序方法是本领域已知的。美国专利第5,302,509号描述了一种用于对多核苷酸模板进行测序的方法，其涉及使用dna聚合酶或dna连接酶执行多个延伸反应以连续地掺入与模板链互补的标记的多核苷酸。在此类sbs反应中，通过连续掺入与模板链互补的单个核苷酸，在5'至3'方向上构建与模板链碱基配对的新多核苷酸链。在测序反应中所用的底物核苷三磷酸利用不同3'标记在3'位处进行标记，从而允许在添加连续核苷酸时测定掺入的核苷酸的同一性。
2、为了使核酸测序反应的通量最大化，有利的是能够并行对多个模板分子测序。可通过使用核酸阵列技术来实现多个模板的并行处理。这些阵列通常由固定到固体载体材料上的多核苷酸的高密度矩阵组成。
3、本领域已描述了用于制造固定化核苷酸测定的阵列的各种方法。wo 98/44151和wo 00/18957均描述了核酸扩增方法，其允许将扩增产物固定在固体载体上以便形成阵列，这些阵列由簇或“集落”组成，其中簇或“集落”由多条相同的固定化多核苷酸链和多条相同的固定化互补链形成。这种类型的阵列在本文中被称为“成簇阵列”。在根据这些方法制备的聚类阵列上的dna集落中存在的
4、已知酶促方法促进寡核苷酸或多核苷酸的有效位点特异性裂解以使双链dna簇线性化并使表面结合的引物脱保护。目前，在各种测序应用中，酶已经广泛用于这两种类型的反应中。然而，酶促方法存在某些问题，包括酶稳定性、酶生产成本、特定储存和处理要求、酶活性的变化和测序读数中的高背景强度。因此，需要开发用于有效dna测序的替代线性化和脱保护方法。然而，由于试剂、条件和副产物(a)必须与上游和下游反应(包括寡核苷酸杂交和变性、引物pcr延伸和dna合成)相容，(b)必须在酸性、碱性和氧化条件下表现出良好的稳定性，(c)必须实现快速清洁的化学反应，以及(d)必须不干扰核苷酸检测方法，因此在这种情况下对可应用于线性化步骤的反应类型存在许多限制。本公开描述了用于双链dna的化学裂解的组合物，其是满足上述要求的有效替代方案。
技术实现思路
1、本公开的一个方面涉及一种使多个固定化双链多核苷酸化学线性化的方法，该方法包括：
2、使钴催化剂与包括该多个固定化双链多核苷酸的固体载体接触，每个双链多核苷酸包括第一链和第二链，其中该第一链和该第二链在它们的5'端处固定到该固体载体，其中每条第二链包括裂解位点；以及
3、用该钴催化剂在该裂解位点处化学裂解一条或多条第二链，并且产生一种或多种裂解的第二核酸和裂解的固定化第二链。
4、在本文所述的化学线性化方法的一些实施方案中，该方法还包括从该固体载体上去除该一种或多种裂解的第二核酸。在一些实施方案中，每条第二链的该裂解位点包括一个或多个二醇接头。在一些实施方案中，该二醇接头包括式(i)的结构：
5、其中r为2、3、4、5或6；并且s为2、3、4、5或6。在一个实施方案中，该二醇接头包括式(ia)的结构：
6、在另外的实施方案中，每条第二链从固定到该固体载体的第二延伸引物延伸，并且其中该第二延伸引物包括第二裂解位点。在另一个实施方案中，该第二延伸引物包括p17序列。
7、本公开的另一方面涉及一种对多核苷酸进行测序的方法，该方法包括：
8、使第一线性化试剂与包括多个固定化双链多核苷酸的固体载体接触，每个双链多核苷酸包括第一链和第二链，其中该第一链和该第二链在它们的5'端处固定到该固体载体，其中每条第一链包括第一裂解位点，并且其中每条第二链包括包含一个或多个二醇接头的第二裂解位点；
9、用该第一线性化试剂在该第一裂解位点处裂解一条或多条第一链，并且产生一种或多种裂解的第一核酸和裂解的固定化第一链；从该固体载体上去除这些裂解的第一核酸；
10、对固定化第二链进行测序；
11、重新合成与这些第二链互补的衍生第一链；
12、使钴催化剂与一条或多条第二链接触以在该第二裂解位点处裂解该第二链，并且产生一种或多种裂解的第二核酸和裂解的固定化第二链；
13、从该固体载体上去除该一种或多种裂解的第二核酸；以及
14、对固定化衍生第一链进行测序。
15、在本文所述的测序方法的一些实施方案中，该第一线性化试剂是pd催化剂。在另外的实施方案中，该pd催化剂是由pd(ii)化合物和水溶性膦原位产生的pd(0)催化剂。在一些实施方案中，每条第一链的该第一裂解位点包括乙烯基部分。在一些实施方案中，该第一裂解位点包括包含式(ii)的结构的经修饰的核苷酸：
16、其中碱基是腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶或它们的衍生物。在另外的实施方案中，每条第一链从固定到该固体载体的第一延伸引物延伸，并且其中该第一延伸引物包括p15序列。在一些实施方案中，该二醇接头包括式(i)的结构：
17、其中r为2、3、4、5或6；并且s为2、3、4、5或6。在一个实施方案中，该二醇接头包括式(ia)的结构：
18、在另外的实施方案中，每条第二链从固定到该固体载体的第二延伸引物延伸，并且其中该第二延伸引物包括p17序列。
19、在本文所述的方法的任何实施方案中，钴催化剂可以是多相催化剂。在一些实施方案中，该钴催化剂包含原子分散在中孔氮掺杂碳材料上的钴。在一些实施方案中，该钴催化剂包括包含约3.8wt％co的meso-co-nc-800。在任何实施方案中，该二醇接头在约25℃至约50℃的温度下裂解。
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1.一种使多个固定化双链多核苷酸化学线性化的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括从所述固体载体上去除所述一种或多种裂解的第二核酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中每条第二链的所述裂解位点包括一个或多个二醇接头。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述二醇接头包括式(I)的结构：
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述二醇接头包括式(Ia)的结构：
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中每条第二链从固定到所述固体载体的第二延伸引物延伸，并且其中所述第二延伸引物包括第二裂解位点。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二延伸引物包括P17序列。
8.一种对多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一线性化试剂是Pd催化剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述Pd催化剂是由Pd(II)化合物和水溶性膦原位产生的Pd(0)催化剂。
11.根据权利要求9或10所述的方法
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一裂解位点包括包含式(II)的结构的经修饰的核苷酸：
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中每条第一链从固定到所述固体载体的第一延伸引物延伸，并且其中所述第一延伸引物包括P15序列。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述二醇接头包括式(I)的结构：
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述二醇接头包括式(Ia)的结构：
16.根据权利要求8至15中任一项所述的方法，其中每条第二链从固定到所述固体载体的第二延伸引物延伸，并且其中所述第二延伸引物包括P17序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述钴催化剂是多相钴催化剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述钴催化剂包含原子分散在中孔氮掺杂碳材料上的钴。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述钴催化剂包括具有约3.8wt％Co的Meso-Co-NC-800。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述二醇接头在约25℃至约50℃的温度下裂解。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种使多个固定化双链多核苷酸化学线性化的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括从所述固体载体上去除所述一种或多种裂解的第二核酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中每条第二链的所述裂解位点包括一个或多个二醇接头。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述二醇接头包括式(i)的结构：
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述二醇接头包括式(ia)的结构：
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中每条第二链从固定到所述固体载体的第二延伸引物延伸，并且其中所述第二延伸引物包括第二裂解位点。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二延伸引物包括p17序列。
8.一种对多核苷酸进行测序的方法，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一线性化试剂是pd催化剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述pd催化剂是由pd(ii)化合物和水溶性膦原位产生的pd(0)催化剂。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中每条第一链的所述第一裂解位点包括乙烯...
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