本发明专利技术公开了一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料及其使用方法，选取与正常关节软骨细胞外基质主要成分相同的材料作为原料，通过溶解及ｐＨ调节，制得低温条件下为溶胶态、体温为凝胶态的注射型软骨仿生基质材料；以其为载体于低温条件下与种子细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使注入材料相变为凝胶，从而将种子细胞固定于缺损发挥再生修复作用，该方法简单易行，产品使用方便、手术损伤小、缺损部位修复效果好；原料具有良好的生物相容性和安全性，各组份可在本发明专利技术制备条件下发生分子间键合，解决单一仿生材料降解过快问题；种子细胞直接与材料混合，无需体外培养，缩短了种子细胞在体外滞留时间，临床应用更安全。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及再生医学
，特别涉及一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿 生基质材料及使用方法。
技术介绍
由创伤或骨病所致关节部位软骨缺损临床常见，现有治疗措施均存在明显缺陷， 快速发展的组织工程学技术为其再生修复提供了新技术。1984年瑞典医学家Peterson等 首次报道在兔关节软骨缺损模型中，用可吸收缝合线将自体骨膜缝合于软骨缺损周缘，然 后将自体软骨细胞悬液注入缺损中，术后16周检测证实关节软骨缺损被透明软骨修复。 1987年瑞典歌德堡医疗中心Brittberg等报道采用该技术成功治疗人关节软骨缺损，这为 随后深入开展的软骨组织工程推广应用创造了有利条件。1995年美国Genzyme公司改良该 技术用于制备较原始的软骨组织工程产品，并注册为Carticel 产品，1997年通过美国 FDA批准后逐渐在临床推广应用，2000年瑞典Sahlgrenska医院Peterson等报告了 101例 膝关节软骨缺损的患者接受ACT技术的治疗情况，其中94例经过2 9年随访，临床有效 率达87.5%。至今已有上万名患者受益于该技术。该技术的基本过程为，在关节镜下采集 患者关节非负重区少量软骨(约黄豆大小)，进行软骨细胞分离、培养及增殖，然后将软骨 细胞种植在生物膜(I/III胶原膜)上构建组织工程软骨，这个过程约一月。在组织工程中，支架材料起到细胞外基质的作用，有利于细胞的黏附、增殖乃至分 化，为植入细胞新陈代谢提供适宜的生产微环境，因此支架材料一直是组织工程组织研究 的重点内容。针对组织工程软骨的支架材料，目前主要有两种策略，即可注射型支架和三维 多孔支架。可注射型支架一般是将细胞与流动性和生物相容性好的材料复合，然后直接注 射到软骨缺损部位，注入的材料原位形成一种具有一定形状、机械强度的支架，体液可在支 架内交换并为支架内的细胞提供生长所需要的营养，进而细胞进行生长、分化和增殖并形 成组织。相对于三维多孔支架而言，可注射型支架因注射植入，手术难度低，创面小，是目前 组织工程支架研究的重要方向之一。近年来，水凝胶作为可注射支架材料广泛用于软骨组织工程，它即可以直接植入 体内作为软骨组织的替代材料，也可以在水凝胶凝胶化之前与细胞悬液混合以形成水凝胶 与细胞的复合体，此类复合体或者在体外进行软骨细胞的三维立体培养，或者注入体内软 骨缺损处，并通过条件改变在体内原位交联，进而修复受损的软骨组织。水凝胶类可注射支 架主要包括温敏型和交联型。交联型水凝胶需要添加交联剂或者引发剂，然后通过适当条 件使分子链之间交联，形成水凝胶。交联型水凝胶的凝胶化时间可通过加入物质的量来调 节，其强度相对较高，但引发剂及交联剂具有的生物毒性会对细胞成活及生长造成不利影 响。温敏型水凝胶无需添加任何助剂，植入后生物相容性及安全性更高。温敏型水凝胶具体又分为升温型水凝胶(如聚氧化乙烯水凝胶)和降温型水凝胶 (如琼脂凝胶)，而升温型水凝胶因凝胶过程为从低温到高温，操作易控，更适宜用于可注 射软骨支架的制备。升温型水凝胶中，合成水凝胶相对于天然水凝胶具备性能稳定、强度高和易操作的优点，但生物相容性较低，细胞粘附效果差。合成温敏型水凝胶及天然水凝胶改 性获得温敏型水凝胶均为现今研究的热点。例如王东武、杨柳等向壳聚糖酸性溶液中加入 甘油磷酸钠得到软骨组织工程用可注射温固化支架，用于修复兔膝关节面缺损，12周后可 见较好的修复效果。李石保、杨维东等采用丙二醇及聚氧化乙烯_聚氧化丙烯_聚氧化乙 烯三嵌段共聚物制得合成温固化水凝胶，注射入裸鼠背部皮下组织后12周可见有大量成 熟的软骨组织。研究表明，正常关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，两者协调配合，保证了关 节软骨的正常生理功能。软骨细胞占整个组织体积的5%，主要功能为分泌胞外基质，保持 基质的更新。细胞外基质70%由水构成，其余由胶原和蛋白多糖组成，主要负责承载软骨 细胞，调节细胞的增殖和分化，缓冲关节应力。胶原占软骨干重的60% -80%，其中95%为 II型胶原。蛋白多糖聚合物占透明软骨干重的20% -40%，主要包括硫酸软骨素和透明质 酸，两者结合形成蛋白多糖聚合物。聚合物中的氨基葡聚糖残基带有负电荷，分子间相互排 斥，具有强烈的亲水性，这是软骨基质保持大量水分的重要原因。硫酸软骨素和胶原纤维之 间的键连接，避免了基质过度水化，进而防止软骨软化。综上所述，用三维多孔支架方式构建软骨，接种细胞后需要进行体外培养，且使用 不方便，必须事先塑形使之与软骨缺损相匹配且以往研究所用生物材料多为人工合成的高 分子材料，与正常的软骨基质成分存在显著的差异，生物相容性和安全性较差。有必要克服所述缺陷，提供一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料， 该材料在低温条件下呈溶胶态、具有流动性，近似体温条件下(36-38°C )发生相变呈凝胶 状；可作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比例的自体骨髓间充质干细胞或软骨细胞 混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度使溶胶发生相变，从而将种子细胞固定 于缺损处发挥再生修复作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材 料及其使用方法，该材料在低温条件下(0_4°C)呈溶胶态、具有流动性，近似体温条件下 (36-380C )发生相变呈凝胶状、不具流动性，可作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比 例的自体骨髓间充质干细胞或软骨细胞混合并注入软骨缺损部位，通过升高缺损区域温度 使溶胶发生相变，从而将种子细胞固定于缺损处发挥再生修复作用，具有使用方便、操作简 单、手术损伤小、修复作用好等优点。本专利技术所述用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，是通过如下步骤制 得a.按质量百分比取65 75%的II型胶原蛋白、20 30%的硫酸软骨素和1 5%的透明质酸作为原料；b.于0 4°C无菌条件下，将步骤a所取原料用浓度为O.Olmol/L 0. Imo 1/L 的冰醋酸或盐酸溶解，得原料质量分数为10% 30%酸性溶液；c.于0 4°C无菌条件下，将所述酸性溶液用浓度为lmol/L 2mol/L的氢氧化 钠或氢氧化钾水溶液中和至pH为7. 0 7. 5，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生 基质材料，于0 4°C温度下保存。进一步，所述原料中各成分的质量百分比为68 73%的II型胶原蛋白、24 29%的硫酸软骨素和1 3%的透明质酸；进一步，步骤b中所用冰醋酸或盐酸的浓度为0. 03-0. 08mol/L，所述酸性溶液中 原料的质量分数为12-18%。使用所述用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料的方法，包括如下步骤1)将分离所得自体或异体的骨髓间充质干细胞或软骨细胞于0_4°C无菌条件下 与所述注射型软骨仿生基质材料混合，制得细胞浓度为5 X 106-5 X IO7个/ml的细胞材料复 合物；2)将所述复合物于0_4°C无菌条件下注入软骨缺损部位，并保持所述部位的温度 在36-38°C直至注射入所述部位的复合物相变为凝胶。本专利技术的有益效果在于所述用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料可 作为种子细胞载体，于低温条件下与一定比例的干细胞或软骨细胞混合并注入软骨缺损部 位，通过升高缺损区域温度使溶胶_细胞复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，其特征在于：通过如下步骤制得：ａ．按质量百分比取６５～７５％的Ⅱ型胶原蛋白、２０～３０％的硫酸软骨素和１～５％的透明质酸作为原料；ｂ．于０～４℃无菌条件下，将步骤ａ所取原料用浓度为０．０１ｍｏｌ／Ｌ～０．１ｍｏｌ／Ｌ的冰醋酸或盐酸溶解，制得原料质量分数为１０％～３０％酸性溶液；ｃ．于０～４℃无菌条件下，将所述酸性溶液用浓度为１ｍｏｌ／Ｌ～２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中和至ｐＨ为７．０～７．５，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，于０～４℃温度下密封保存。
【技术特征摘要】
一种用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，其特征在于通过如下步骤制得a.按质量百分比取65～75％的II型胶原蛋白、20～30％的硫酸软骨素和1～5％的透明质酸作为原料；b.于0～4℃无菌条件下，将步骤a所取原料用浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的冰醋酸或盐酸溶解，制得原料质量分数为10％～30％酸性溶液；c.于0～4℃无菌条件下，将所述酸性溶液用浓度为1mol/L～2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾水溶液中和至pH为7.0～7.5，得所需用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，于0～4℃温度下密封保存。2.根据权利要求1所述的用于软骨再生修复的注射型软骨仿生基质材料，其特征在 于所述原料中各成分的质量百分比为68 73%的II型胶...
【专利技术属性】
技术研发人员：王富友，杨柳，张颖，段小军，戴刚，宁志刚，崔运利，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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