【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。
技术介绍
1、作为从培养液中分离纯化有用物的方法，已知使用了分离膜的方法。
2、在日本特开平3-39084号公报中，记载了通过使用截留分子量10000～1000000的中空纤维型超滤膜(uf膜)组件对单细胞藻类的培养液进行错流过滤来进行浓缩时，进行定期的伏流清洗的单细胞藻类培养液的浓缩方法的专利技术。
3、当通过错流过滤将培养液浓缩时，在uf膜的外侧存在浓缩液，透过液进入uf膜的内侧。当进行伏流清洗时，清洗水进入uf膜的内侧后，流出到uf膜的外侧，由此清洗uf膜。
4、在日本特开2018-76291号公报中记载了一种回收有用物质的方法的专利技术，其包括：渗出工序，从细胞的培养槽排出培养液，将与排出的培养液等量的新鲜培养基加入到上述培养槽中；以及过滤工序，使用实质上不具有致密层的多孔膜对从上述培养槽提取的培养液进行过滤，上述过滤工序中的过滤为切向流过滤，所述过滤工序中的透过液的速度为1.0lmh以下。
5、记载了上述有用物质选自由蛋白质、病毒、外泌体以及核酸构成的组中。作为上述切向流过滤，还记载了可以实施交替切向流过滤。细胞外囊泡是指被释放到细胞外的、由脂双层覆盖的、不具有核的颗粒的总称，包括核酸、蛋白质、脂质、各种代谢产物等，相当于外泌体、微泡以及凋亡囊泡等。
6、在cytometry research 26(1)：1～6，2016“基于exosome的液体活检的新展开”(日文：“exosomeによるリキッドバイオプシー
技术实现思路
1、本公开的技术问题在于提供一种用于分离纯化细胞外囊泡的分离纯化方法。
2、本公开提供一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其利用中空纤维膜对包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液进行过滤，
3、所述中空纤维膜是内径为0.2mm～1.4mm、截留分子量为10万～100万的中空纤维膜，
4、所述过滤方法具有：第一过滤工序，将所述间充质干细胞的培养上清液从所述中空纤维膜的一端侧的第一开口部压入并过滤，分离为透过液和第一浓缩液；以及
5、第二过滤工序，将所述第一浓缩液从所述中空纤维膜的另一端侧的第二开口部压入并过滤，分离为透过液和第二浓缩液，
6、所述过滤方法是通过交替实施多次所述第一过滤工序和所述第二过滤工序的交替切向流过滤，得到所述细胞外囊泡的浓度提高的浓缩液的方法，
7、所述第一过滤工序和所述第二过滤工序中的膜面速度为0.3m/sec～2m/sec。需要说明的是，膜面速度是指膜面上的线速度。
8、根据本公开的一个实施方式，也可以是，所述过滤方法为如下工序：将所述间充质干细胞的培养上清液利用孔径0.1μm～0.5μm的微滤膜过滤后，使用所述微滤膜的滤液，交替实施多次所述第一过滤工序和所述第二过滤工序的工序。
9、根据本公开的一个实施方式，也可以是，在实施所述第一过滤工序时，对间充质干细胞的培养上清液或在所述第二过滤工序中得到的第二浓缩液加入缓冲液进行稀释后，实施所述第一过滤工序。
10、根据本公开的一个实施方式，也可以是，所述第一过滤工序和所述第二过滤工序是通过引入选自氮气、惰性气体、二氧化碳、经hepa过滤器过滤的空气中的气体来压入并实施的。
11、根据本公开的一个实施方式，也可以是，使包含成为起始原料的细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液中所含的蛋白质量减少至1/5以下的量。
12、根据本公开的一个实施方式，也可以是，经分离纯化的浓缩液中的胰岛素浓度为5mg/l以下。
13、根据本公开的一个实施方式，也可以是，以所述间充质干细胞的培养上清液中所含的细胞外囊泡的量为基准时，就所述浓缩液中所含的细胞外囊泡的使用exoscreen法测定的量而言，浓缩倍率为5倍以上且回收率为50％以上。
14、根据本公开的一个实施方式，也可以是，所述中空纤维膜为在具有多个液体出入口的外壳内容纳有多根中空纤维膜的中空纤维膜组件。
15、根据本公开的一个实施方式，也可以是，当交替实施所述第一过滤工序和所述第二过滤工序时，随着所述实施次数增加，使第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数增加。
16、根据本公开的一个实施方式，也可以是，当交替实施所述第一过滤工序和所述第二过滤工序时，随着所述实施次数增加，使第一过滤工序的过滤对象的稀释倍数在2容量倍～15容量倍的范围内增加。
17、根据本公开的细胞外囊泡的分离纯化方法，可以将细胞外囊泡浓缩至高浓度。
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1.一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其利用中空纤维膜对包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液进行过滤，
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
3.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
8.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
9.根据权利要求1～7中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
10.根据权利要求1～8中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞外囊泡的分离纯化方法，其利用中空纤维膜对包含细胞外囊泡的间充质干细胞的培养上清液进行过滤，
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
3.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，
5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞外囊泡的分离纯化方法，其中，<...
【专利技术属性】
技术研发人员：中塚修志，内村诚一，落谷孝广，吉冈祐亮，
申请(专利权)人：株式会社大赛璐，
类型：发明
国别省市：
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