【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程菌株构建，尤其涉及一种基因工程菌及其在生产麦角硫因中的应用。
技术介绍
1、麦角硫因是一种具有独特生物学功能和药理活性的手性组氨酸衍生物，具有广泛的生物医药应用前景。由于其独特的化学性质和生物活性，麦角硫因在食品、化妆品、医药等领域具有广泛的应用前景和市场前景。
2、麦角硫因的合成方法主要包括化学合成法、提取法、生物发酵法和生物催化法。其中，酶催化是研究最为广泛的麦角硫因生产方法。在真核生物中的麦角硫因合成主要涉及egt1和egt2两个关键酶，egt1催化半胱氨酸和组氨酸甜菜碱合成亚砜中间体(图1)。然后，在强还原环境中，egt2裂解亚砜中间体生成麦角硫因(图2)。
3、然而，目前麦角硫因的酶催化合成方法仍然存在一些问题。例如：工程菌培养时间长，蛋白表达量低；酶活不高，生产效率降低；酶底物耐受性差，转化率低。
4、申请公告号为cn110551697b的专利技术专利公开了一种侧耳类食用菌麦角硫因合成酶pegt1和pegt2在合成麦角硫因中的应用，该专利技术从侧耳类食用菌平菇、白灵菇、杏鲍菇出发，克隆并功能鉴定了这三种侧耳类食用菌麦角硫因合成编码相关基因。
5、申请公开号为cn116355820a的专利技术专利申请公开了一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法，该工程菌株以大肠杆菌为底盘菌株，在底盘菌株中过表达麦角硫因合成基因簇egtbde、麦角硫因生物合成蛋白egt1编码基因、麦角硫因生物合成蛋白egt2编码基因中的一种或几种。
6、虽然，上述
技术实现思路
1、本专利技术针对现有麦角硫因合成工艺存在的缺陷，提供了高产麦角硫因的基因工程菌以及利用该基因工程菌一锅法制备麦角硫因的方法；该基因工程菌不仅具有较高的酶活，还能够在较短反应时间内达到较高的转化率，且ee值高。
2、具体技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因由目的基因i和目的基因ii组成；所述目的基因i如seq id no.1所示；所述目的基因ii如seq id no.2或seq id no.3所示。
4、其中，目的基因i，简称egt1基因，来源于嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)；目的基因ii，简称egt1基因，来源于长枝木霉菌(trichodermalongibrachiatum)或哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)。
5、本专利技术对分别来自于trichoderma harzianum(thegt1)、myceliophthorathermophila(mtegt1)、neurospora tetrasperma(ntegt1)、fusarium longipes(flegt1)、xylaria grammica(xgegt1)等物种的egt1基因(数据库uniprot的登录号分别依次为a0a0f9xqs5、g2q5s1、g4ukz4、a0a395suf0、a0a439d8x8)和分别来自于trichodermalongibrachiatum(tlegt2)、trichoderma harzianum(thegt2)等物种的egt2基因(数据库uniprot的登录号分别为a0a2t4bwp1、a0a0g0a2b8)进行了筛选和配组。
6、发现：只有来源于嗜热毁丝霉(myceliophthora thermophila)的egt1基因与来源于长枝木霉菌(trichoderma longibrachiatum)和哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)的egt2基因进行表达才能够获得高酶活、高转化率和高ee值的高产麦角硫因的基因工程菌。
7、进一步地，所述目的基因i和目的基因ii共同插入至同一游离型质粒i上并转入同一宿主细胞内；或者，目的基因i和目的基因ii分别单独插入至游离型质粒ii上再转入同一种类的宿主细胞内。
8、本专利技术提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt1的表达载体。所述的表达载体为将egt1插入pet28-a(+)表达质粒bamh i和hind iii酶切位点之间，包括pet28a-thegt1、pet28a-mtegt1、pet28a-ntegt1、pet28a-flegt1、pet28a-xgegt1。
9、本专利技术提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt2的表达载体。所述的表达载体为将egt2插入pet28-a(+)表达质粒bamh i和hind iii酶切位点之间，包括pet28a-tlegt2、pet28a-thegt2。
10、本专利技术提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt1和egt2的共表达载体。使用petduet-1共表达质粒，将麦角硫因合成基因egt1插入多克隆位点bamh i和hind iii之间，将麦角硫因合成基因egt2插入多克隆位点nde i和xho i之间，包括petduet-thegt1-tlegt2、petduet-mtegt1-tlegt2、petduet-ntegt1-tlegt2、petduet-flegt1-tlegt2、petduet-xgegt1-tlegt2。
11、本专利技术提供了包含所述egt1基因的escherichia coli bl21(de3)工程菌：bl21-pet28a-thegt1、bl21-28a-mtegt1、bl21-28a-ntegt1、bl21-28a-flegt1、bl21-28a-xgegt1。
12、本专利技术提供了包含所述egt2基因的escherichia coli bl21(de3)工程菌：bl21-28a-tlegt2、bl21-28a-thegt2。
13、本专利技术提供了包含所述egt1基因的vibrio natriegens vndx工程菌：vndx-pet28a-thegt1、vndx-28a-mtegt1、vndx-28a-ntegt1、vndx-28a-flegt1、vndx-28a-xgegt1。
14、本专利技术提供了包含所述egt2基因的vibrio natriegens vndx工程菌：vndx-28a-tlegt2、vndx-28a-thegt2。
15、本专利技术提供了包含所述egt1和tlegt2基因的escherichia coli bl21(de3)共表达工程菌bl21-duet-thegt1-tlegt2、bl21-duet-mtegt1-tlegt2、bl21-duet-ntegt1-tlegt2、bl21-duet-flegt1-tlegt2、bl21-duet-xgegt1-tlegt2。
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因由目的基因I和目的基因II组成；所述目的基因I如SEQ ID NO.1所示；所述目的基因II如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述目的基因I和目的基因II共同插入至同一游离型质粒I上并转入同一宿主细胞内；
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)或者需钠弧菌(Vibrio natriegens VnDX)。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述游离型质粒I为pETDuet-1质粒；游离型质粒II为pET28-a(+)质粒。
5.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述需钠弧菌为需钠弧菌(Vibrionatriegens)ATCC14048。
6.如权利要求1～5任一项所述的基因工程菌在生产麦角硫因中的应用。
7.一种麦角硫因的生产方法，其特征在于，包括：以组氨酸
8.如权利要求7所述的麦角硫因的生产方法，其特征在于，所述催化反应以水为溶剂，反应温度为25℃～40℃，pH值为6～9。
9.如权利要求7所述的麦角硫因的生产方法，其特征在于，所述组氨酸甜菜碱的浓度为50mM～500mM，L-半胱氨酸的浓度为75mM～750mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或1,4-二硫苏糖醇的浓度为25mM～75mM，磷酸吡哆醛的浓度为50μM～200μM，亚铁离子的浓度为50μM～200μM。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因由目的基因i和目的基因ii组成；所述目的基因i如seq id no.1所示；所述目的基因ii如seq id no.2或seq id no.3所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述目的基因i和目的基因ii共同插入至同一游离型质粒i上并转入同一宿主细胞内；
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)或者需钠弧菌(vibrio natriegens vndx)。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述游离型质粒i为petduet-1质粒；游离型质粒ii为pet28-a(+)质粒。
5.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述需钠弧菌为需钠弧菌(vibrionatriegen...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑文隆，吴坚平，王六伟，郑庆泉，梁伟周，方赛，李俊宇，
申请(专利权)人：广州同隽医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。