本发明专利技术涉及野生动物物种鉴定领域，尤其涉及指基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的分子标记、引物及其应用通用性鉴定鸟类物种的分子标记、引物及其应用，并评估该方法在单一鸟类样本和混合鸟类样本中的灵敏度和适用性；本发明专利技术在线粒体多个DNA条形码标记上设计引物，这些引物在鸟类中具有普遍适用性，并有助于在降解样本中识别鸟类，相较于现有的鉴定方法，该方法不仅可以对单一鸟类样本进行物种鉴定，并且可解决鸟类混合样本鉴定的问题，实现了高灵敏度、高通量、节省试剂和珍贵样本等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及野生动物物种鉴定领域，尤其涉及基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的分子标记、引物及其应用。
技术介绍
1、鸟类是地球上最丰富的脊椎动物类群之一，具有极高的物种多样性。它们在不同生态系统中履行各种角色，对维持生物多样性起着重要作用。其中我国的鸟类资源十分丰富，在动物地理区划上横跨了古北界和东洋界两大区系，在世界鸟类学研究中占有重要的位置，珍稀濒危鸟类更是生物多样性保护的重要类群。为了规范管理涉及鸟类的经济活动，在规范管理和执法的过程中需要制定完善的物种鉴定方法。
2、目前遇到的对鸟类进行物种鉴定的情况主要分为两种：单一鸟类样本的物种鉴定和混合鸟类样本的物种鉴定。其中对单一鸟类样本的物种鉴定技术比较成熟，如dna条形码、pcr-rflp、snp分析等等，但是仍存在如下的缺陷：
3、(1)某些鸟类物种在分子水平上可能存在遗传相似性，导致基于单一分子标记的序列结果可能会比对到多个物种，难以准确鉴定。因此需要增加其他分子标记再次确认才能精准鉴定，该过程增大了实验量、浪费试剂和样本。
4、(2)对于分子标记分析，需要较高质量的dna样本，如血液、组织或粪便样本。样本的质量和来源可能对鉴定结果产生影响，如受到降解、污染等。
5、而针对混合鸟类样本物种鉴定技术仍停留在研究阶段且存在以下缺陷：
6、(1)对于复杂的混合样本，不同物种的丰度和比例可能存在差异，这可能影响鉴定的灵敏度和特异性。低丰度物种可能难以被准确鉴定或容易被高丰度物种所掩盖。
7、(2)目前的鸟类通用引物扩增片段较长，对低品质样本容忍度低，从中扩增高质量目的片段具有挑战性。
8、(3)目前种源鉴定中使用最广泛的是基于sanger测序的dna条形码技术，该技术在常规的检测中可以实现单一样品的种源鉴定，但对混合样品进行全面的种源成分分析十分耗时。
9、(4)一代测序在针对多个物种混合的样品中，通常会采用克隆的方式，即将扩增子克隆导入质粒载体中，并导入感受态细胞，进而获得单一样品的单个物种片段。但是克隆的方法成本较高，时间较长，且无法保证所有的dna片段完整的导入到宿主细胞中，最终克隆结果无法做到全面性和准确性。
10、(5)由于缺乏将所有鸟类dna片段都扩出的通用引物，使用通用dna条形码可能导致不能扩增出混合样品中包含的每个物种的相关条形码，因此往往需要多对引物进行多次扩增，操作复杂，浪费样本。
11、(6)对于特定的分子标记方法，设计合适的引物对于不同物种的鉴定至关重要。如果引物的特异性不足或存在交叉反应，可能导致误判或无法鉴定特定物种。
12、(7)对于混合样本的复杂数据，准确解读和分析不同物种的信息是具有挑战性的。需要使用专业的生物信息学工具和分析方法来处理多样本序列数据，以便能准确和敏感地鉴定物种。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的是上述鉴定鸟类样本中准确率低、操作复杂等问题，本专利技术公开了基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的分子标记，根据该分子标记设计通用引物对待鉴定样品进行扩增、测序，即可实现鸟类物种的有效鉴定，该方法有助于严重降解样本或高度加工样本的鸟类识别，在鸟类中具有普遍适用性。
2、为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：
3、提供基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的分子标记，所述分子标记包括编码细胞色素b基因片段1、编码细胞色素b基因片段2、编码细胞色素c氧化酶亚基i基因片段和/或编码12s rrna基因片段，
4、所述编码细胞色素b基因片段1包括seq id no：1
5、ccattccacccttactactccctcaaagacatcctaggcttagcactgatactcaccccattccttacattagccctattctcaccaaaccttctaggcgacccagaaaacttcaccccagcaaacccactagtaacccctcctcatattaaaccagaatgatacttcttattcgcctacgccatcctacgctcaatcccaaataaactcggaggcgt所示核苷酸序列；
6、所述编码细胞色素b基因片段2包括seq id no：2
7、caacaactccctaatcgacctacccgccccctccaacatctctgcttgatgaaacttcggttccctgctagcagtatgccttattactcaaatcctcactggcctcctattagccatacattacaccgcagatac所示核苷酸序列；
8、所述编码细胞色素c氧化酶亚基i基因片段包括seq id no：3
9、cccagacatagcattcccacgtataaacaacataagcttctgacttctccccccctcctttctcctcctgctagcctcctcaaccgtagaagctggagccggtaccggatgaactgtttacccccccttagctggaaaccttgctcacgccggtgcatcagtagatctggccattttctccctccatctcgcaggtg所示核苷酸序列；
10、所述编码12s rrna基因片段包括seq id no：4
11、tgcatccgcccgaga--actacga-gcacaaacgctt-aaaactctaagga-cttggcggtgccccaaacccacctaga--ggagcctgttctataatcgataatccacgat--ccacccaaccaccccttgcca---aca-cagcctacataccgccgtcgccagcccacct-a--aatgaaaggcc-aacagtgagctcaacagtc---------c-accactag---------caagacaggtcaaggtatagcccat-ggggtggaagaaatgggct所示核苷酸序列。
12、本专利技术提供的基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的引物，所述引物组满足以下要求：
13、(1)每组引物分别通过primer premier 5.0四种重要指标分析，包括发夹结构(hairpin)，二聚体(dimer)，错误引物情况(false priming)，及上下游引物之间二聚体(cross dimer)。
14、(2)每组引物的扩增片段长度不同且均小于300bp。
15、(3)多组引物混合后通过dnastar primer select重要指标分析。
16、(4)每组引物的退火温度相近，有利于后续的多重pcr，提高分析效率。
17、进一步地：
18、引物组1用于扩增含编码细胞色素b基因片段1的序列，包括：
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【技术保护点】
1.基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括编码细胞色素b的基因片段1、编码细胞色素b的基因片段2、编码细胞色素c氧化酶亚基I的基因片段和/或编码12S rRNA的基因片段，
2.基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的引物，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的引物，其特征在于，可将所述引物组的一条引物的5’端标上荧光基团，所述荧光基团为FAM、HEX、ROX或TAMRA。
4.基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述引物。
5.基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的方法，其特征在于，所述步骤(2)中单独进行PCR扩增体系为：2×Taq PCR MasterMix 5μL，上下游引物各0.4μL，DNA模板1.0μL，去离子水3.2μL补足至总体积为10μL；PCR反应扩增程序为：95℃变性1min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
7.根据权利要求5所述的基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的方法，其特征在于，所述步骤(2)中多重PCR扩增体系为：Multiplex PCR AssayKitVer.210.1μL，每种引物0.6μL，DNA模板1.0μL，去离子水4.1μL补足至总体积为20μL；PCR反应扩增程序为：94℃变性1min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环。
8.根据权利要求5所述的基于线粒体DNA多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的方法可以应用在混合样本中的物种鉴定。
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【技术特征摘要】
1.基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括编码细胞色素b的基因片段1、编码细胞色素b的基因片段2、编码细胞色素c氧化酶亚基i的基因片段和/或编码12s rrna的基因片段，
2.基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的引物，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的引物，其特征在于，可将所述引物组的一条引物的5’端标上荧光基团，所述荧光基团为fam、hex、rox或tamra。
4.基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述引物。
5.基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用性鉴定鸟类物种的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于线粒体dna多区段扩增子高通量测序的通用...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐艳春，于梦佳，庞坤杰，高昀露，郭小森，杨淑慧，朱兆章，王文慧，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：
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