【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程菌株构建，尤其涉及一种高产麦角硫因的基因工程菌及其在生产麦角硫因中的应用。
技术介绍
1、麦角硫因是一种具有独特生物学功能和药理活性的手性组氨酸衍生物，具有广泛的生物医药应用前景。由于其独特的化学性质和生物活性，麦角硫因在食品、化妆品、医药等领域具有广泛的应用前景和市场前景。
2、麦角硫因的合成方法主要包括化学合成法、提取法、生物发酵法和生物催化法。化学法合成麦角硫因光学纯度低，难度大，原料2-巯基咪唑制备工艺复杂成本较高，且存在原料昂贵和得率低等问题。提取法是以蘑菇等担子菌为原料提取麦角硫因，尽管该方法比较普遍，但是其生产成本高，存在原料来源不足和提取困难等问题，并且可能会有药物残留。发酵法是通过发酵技术，对天然来源富集含麦角硫因的微生物进行发酵，或通过基因工程和代谢工程等生物技术，在大肠杆菌、酵母菌等模式微生物中构建麦角硫因合成通路，通过发酵获得麦角硫因。例如，将来自耻垢分枝杆菌的egtabcde基因簇或真菌生物合成途径中麦角硫因合成基因egt1和egt2在大肠杆菌中进行异源表达，将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高麦角硫因产量。该方法相较于化学法和提取法有了巨大进步，产物产量进一步提升。但是，发酵周期长，一般为72-120小时，发酵过程控制难度大，往往产生杂菌污染等生产事故，导致生产效率低，产物品质不稳定。此外，该方法还需要利用溶剂提取技术从细胞体内提取麦角硫因，得率较低，产量仅为毫克级别。
3、目前，酶催化是研究最为广泛的麦角硫
4、因此，进一步挖掘催化活性高的麦角硫因合成酶，利用基因工程技术构建培养时间短、蛋白表达量高的生物工程菌催化合成麦角硫因具有重要的意义。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有麦角硫因合成工艺存在的缺陷，提供了高产麦角硫因的基因工程菌以及利用该基因工程菌一锅法制备麦角硫因的方法；该基因工程菌不仅具有较高的酶活，还能够在较短反应时间内达到较高的转化率，且ee值高。
2、具体技术方案如下：
3、本专利技术提供了高产麦角硫因的基因工程菌，该基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因；所述目的基因包含egt1基因和egt2基因；
4、所述egt1基因来源于嗜热毛壳菌(chaetomium thermophilum)；所述egt2基因来源于长枝木霉菌(trichoderma longibrachiatum)或哈茨木霉菌(trichodermaharzianum)。
5、本专利技术对分别来自于trichoderma harzianum(thegt1)、chaetomiumthermophilum(ctegt1)、neurospora tetrasperma(ntegt1)、fusarium longipes(flegt1)、xylaria grammica(xgegt1)等物种的egt1基因(数据库uniprot的登录号分别依次为a0a0f9xqs5、g0s440、g4ukz4、a0a395suf0、a0a439d8x8和分别来自于trichodermalongibrachiatum(tlegt2)、trichoderma harzianum(thegt2)等物种的egt2基因(数据库uniprot的登录号分别为a0a2t4bwp1、a0a0g0a2b8)进行了筛选和配组。
6、发现：来源于嗜热毛壳菌(chaetomium thermophilum)的egt1基因与来源于长枝木霉菌(trichoderma longibrachiatum)和哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)的egt2基因进行表达能够获得高酶活、高转化率和高ee值的高产麦角硫因的基因工程菌。
7、进一步地，所述高产麦角硫因的基因工程菌为基因工程菌i，或者由基因工程菌ii-1和基因工程菌ii-2混合而成；
8、所述基因工程菌i由egt1基因和egt2基因共同插入至同一游离型质粒i上并转入同一宿主细胞内获得；
9、所述基因工程菌ii-1由egt1基因单独插入至游离型质粒ii上再分别转入同类的宿主细胞内获得；所述基因工程菌ii-2由egt2基因单独插入至游离型质粒ii上再分别转入同类的宿主细胞内获得。
10、本专利技术提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt1的表达载体。所述的表达载体为将egt1插入pet28-a(+)表达质粒bamh i和hind iii酶切位点之间，包括pet28a-thegt1、pet28a-ctegt1、pet28a-ntegt1、pet28a-flegt1、pet28a-xgegt1。
11、本专利技术提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt2的表达载体。所述的表达载体为将egt2插入pet28-a(+)表达质粒bamh i和hind iii酶切位点之间，包括pet28a-tlegt2、pet28a-thegt2。
12、本专利技术提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt1和egt2的共表达载体。使用petduet-1共表达质粒，将麦角硫因合成基因egt1插入多克隆位点bamh i和hind iii之间，将麦角硫因合成基因egt2插入多克隆位点nde i和xho i之间，包括petduet-thegt1-tlegt2、pet duet-ctegt1-tlegt2、petduet-ntegt1-tlegt2、petduet-flegt1-tlegt2、petduet-xgegt1-tlegt2。
13、本专利技术提供了包含所述egt1基因的escherichia coli bl21(de3)工程菌：bl21-pet28a-thegt1、bl21-28a-ctegt1、bl21-28a-ntegt1、bl21-28a-flegt1、bl21-28a-xgegt1。
14、本专利技术提供了包含所述egt2基因的escherichia coli bl21(de3)工程菌：bl21-28a-tlegt2、bl21-28a-thegt2。
15、本专利技术提供了包含所述egt1基因的vibrio natriegens vndx工程菌：vndx-pet28a-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因；所述目的基因包含egt1基因和egt2基因；所述egt1基因来源于嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)；所述egt2基因来源于长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)或哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。
2.如权利要求1所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述高产麦角硫因的基因工程菌为基因工程菌I，或者由基因工程菌II-1和基因工程菌II-2混合而成；
3.如权利要求2所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))或者需钠弧菌(Vibrio natriegens VnDX)。
4.如权利要求3所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，游离型质粒I为pETDuet-1质粒，egt1基因插入该质粒多克隆位点的BamHI和Hind III之间；egt2基因插入该质粒多克隆位点的Nde I和Xho I之间；
<...【技术特征摘要】
1.高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因；所述目的基因包含egt1基因和egt2基因；所述egt1基因来源于嗜热毛壳菌(chaetomiumthermophilum)；所述egt2基因来源于长枝木霉菌(trichoderma longibrachiatum)或哈茨木霉菌(trichoderma harzianum)。
2.如权利要求1所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述高产麦角硫因的基因工程菌为基因工程菌i，或者由基因工程菌ii-1和基因工程菌ii-2混合而成；
3.如权利要求2所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli bl21(de3))或者需钠弧菌(vibrio natriegens vndx)。
4.如权利要求3所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，游离型质粒i为petduet-1质粒，egt1基因插入该质粒多克隆位点的bamhi和hind iii之间；egt2基因插入该质粒多克隆位点的nde i和xho i之间；
5.如权利要求3所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚平，郑文隆，王六伟，郑庆泉，梁伟周，方赛，李俊宇，
申请(专利权)人：广州同隽医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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