【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环状dna合成，特别是涉及一种简单且高效的大eccdna的合成方法。
技术介绍
1、染色体外环状dna(extrachromosomal circμlar dna，eccdna)是一种独立于染色体外的环状dna分子，广泛地存在于真核细胞中。eccdna不仅在肿瘤发生发展及耐药等过程中发挥着重要作用，而且可以促进先天免疫应答和生成microrna调控基因的表达。然而，某一特定序列的eccdna的功能尚未得到深入的实验探索。这可能是由于缺乏高效且实惠的eccdna的合成方法。
2、目前，eccdna的合成可以在体内和体外进行。eccdna的体内合成主要依赖crispr-cas方法[1]，它需要特定的基因编辑系统，成本高、耗时长且存在脱靶风险。与此同时，体内合成的方法难以控制eccdna的合成量且提纯难度大。eccdna的体外合成多采用lama(ligase-assisted minicircle accumμlation)方法。lama方法[2]以化学合成的单链dna为模板，受限于单链dna的长度，只能合成小eccdna(大多小于100bp)。同时，长单链dna的合成成本高也限制了lama方法的应用。quicklama方法[3]只能合成单一片段组成的eccdna，且需要7个步骤，较为繁琐。越大的eccdna包含越长的基因组序列，多片段组成的eccdna包含多个位点的基因组序列，二者更可能形成独立于染色体的完整基因调控系统，从而发挥更多、更重要的功能。因此，eccdna的深入研究急需开发一种流程简单且高效的e
3、参考文献：
4、1.h.d.et al.crispr-c:circμlarization ofgenes and chromosome bycrispr in human cells.nucleicacids res 46,e131(2018).
5、2.du,q.,kotlyar,a.&vologodskii,a.kinking the double helix by bendingdeformation.nucleic acids res 36,1120-1128(2008).
6、3.zuo,s.,li,x.,yang,y.,zhou,j.&he,q.a quick method to synthesizeextrachromosomal circμlar dnain vitro.molecμles 28(2023).
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种简单且高效的大eccdna的合成方法。该方法成功的解决了两大关键问题：大eccdna的合成步骤繁琐以及无法合成含有多片段的eccdna。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术提供了一种染色体外环状dna的合成方法，包括以下步骤：
4、1)以基因组dna为模板，进行第一轮pcr扩增，得到待合成的染色体外环状dna对应的一个或多个第一线性dna片段；
5、2)以步骤1)所述的第一线性dna片段为模板，进行第二轮pcr扩增，得到扩增产物；所述扩增产物为至少两种第二线性dna片段，且含有待合成的染色体外环状dna的所有序列；以所述第二线性dna片段在待合成的染色体外环状dna的位置排序，相邻第二线性dna片段两侧有15～25bp序列完全重叠；
6、3)采用无缝克隆的方式连接步骤2)中的所有第二线性dna片段，得到初级染色体外环状dna；
7、4)以待合成的染色体外环状dna全长序列设计两对5'端具有磷酸化修饰的引物，以步骤3)所述初级染色体外环状dna为模板，分别经第三轮pcr扩增反应，得到待合成的染色体外环状dna全长序列对应的两个第三线性dna片段；
8、5)利用dna连接酶将步骤4)得到的两个第三线性dna片段连接，得到所述染色体外环状dna。
9、优选的，所述第一轮pcr扩增反应体系为50μl，包括：基因组dna 50ng、正向引物20pmol、反向引物20pmol和余量的pcr反应试剂；
10、所述第二轮pcr扩增反应体系为50μl，包括：模板10ng、正向引物20pmol、反向引物20pmol和余量的pcr反应试剂；
11、所述第三轮pcr扩增反应体系为50μl，包括：模板10ng、正向引物20pmol、反向引物20pmol和余量的pcr反应试剂。
12、优选的，所述第一轮pcr扩增、所述第二轮pcr扩增和所述第三轮pcr扩增的反应程序均为：95℃预变性2min；95℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s/kb，共35个循环；72℃终延伸5min。
13、优选的，所述无缝克隆的反应体系为：dna assembly mix 5μl，每种第二线性dna片段200ng，ddh2o补足至10μl。
14、优选的，所述无缝克隆的反应程序为：50℃反应15min。
15、优选的，步骤4)中每对引物扩增得到的产物大小均为待合成的染色体外环状dna全部序列长度。
16、优选的，步骤5)所述的dna连接酶的的反应程序为：95℃，5min；95℃，20s，4℃，1min，45℃，20min，共10个循环。
17、有益效果：
18、本专利技术提供的合成方法具有简单高效的优势，可用于合成含有多片段的eccdna，且合成的eccdna产量高，纯度高。
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1.一种染色体外环状DNA的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增反应体系为50μl，包括：基因组DNA 50ng、正向引物20pmol、反向引物20pmol和余量的PCR反应试剂；
3.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增、所述第二轮PCR扩增和所述第三轮PCR扩增的反应程序均为：95℃预变性2min；95℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s/kb，共35个循环；72℃终延伸5min。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述无缝克隆的反应体系为：DNAAssembly Mix 5μl，每种第二线性DNA片段200ng，ddH2O补足至10μl。
5.根据权利要求1或4所述的合成方法，其特征在于，所述无缝克隆的反应程序为：50℃反应15min。
6.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，步骤4)中每对引物扩增得到的产物大小均为待合成的染色体外环状DNA全部序列长度。
7.根据权利要求
...【技术特征摘要】
1.一种染色体外环状dna的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述第一轮pcr扩增反应体系为50μl，包括：基因组dna 50ng、正向引物20pmol、反向引物20pmol和余量的pcr反应试剂；
3.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于，所述第一轮pcr扩增、所述第二轮pcr扩增和所述第三轮pcr扩增的反应程序均为：95℃预变性2min；95℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s/kb，共35个循环；72℃终延伸5min。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：程卓，罗玄梅，黄永辉，闫秀娥，
申请(专利权)人：北京大学第三医院北京大学第三临床医学院，
类型：发明
国别省市：
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