【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药仿生领域，具体涉及一种仿生肝小叶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、工程化肝脏长期以来一直被认为有望用于肝病治疗。一般来说，人的肝脏是由微小的径向形态的肝小叶结合血管和胆道网组成的。为了模拟肝脏结构，许多策略被开发来制造三维(3d)肝脏模型。一般情况下，通过应用材料线索的几何图形化，可以将人的实质细胞、基质细胞甚至血管细胞排列成特定的网格结构，模拟间质微结构，实现细胞分布和一些肝脏功能。特别是，生物打印和其他组织工程技术可以构建具有三维结构的结构，进一步实现血管网络和微循环系统。尽管取得了许多成功，但目前的研究大多只是基于几何结构的简单模仿，难以构建出细胞堆积和多细胞结构相互作用的高密度组合物，导致肝组织工程的效果不理想。因此，实现细胞类型、密度和分布的同步构建仍是肝组织工程研究的重要方向。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种仿生肝小叶及其制备方法和应用，可用于制备肝脏芯片进行药物筛选，还可以用于治疗急性肝衰竭。
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案是：
3、一种仿生肝小叶的制备方法，采用3d压印模具将培养的肝细胞片雕刻成具有六边形中空横截面的肝小叶膜片，通过3d压印模具使雕刻的若干个肝小叶膜片逐层压印，并在其中浸润血管内皮细胞，形成具有一定高度、细胞密度及仿生功能的仿生肝小叶。
4、肝细胞片中的肝细胞为ipscs-hep，将肝细胞接种到温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿上，在常规贴壁条件下培养生成肝细胞片。p>
5、当温度从37℃降低至20℃时，培养的肝细胞片从温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿上分离。
6、逐层压印的肝小叶膜片在体外培养1-4小时后各层肝小叶膜片间逐渐融合；在仿生肝小叶中空的中间管腔内灌注人脐静脉内皮细胞。
7、在肝细胞培养时还加入巨噬细胞和肝星状细胞，在温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿中将hipsc-heps、巨噬细胞和肝星状细胞按比例混合培养；hipsc-heps、巨噬细胞和肝星状细胞的混合比例以百分质量比计分别为67.86％、30.16％和1.98％。
8、所述的3d压印模具包括印模主体、推拉装置和推杆头；所述的印模主体包括横截面为正六边形的筒体、内置于筒体中的六角星形实心柱体，所述实心柱体一端与筒体通过安装座固定相连，所述的安装座上分布有三个孔；所述的推拉装置包括推拉盘和固定在推拉盘上的三根圆柱杆，所述推拉盘具有六角星形镂空结构；所述的推杆头上分布有三个圆形凹槽；推拉装置和推杆头组装时，推拉装置的圆柱杆分别从印模主体的六角星形实心柱体周围间隔的穿过，推拉盘的六角星形镂空结构穿过印模主体的六角星形实心柱体，推拉盘的圆柱杆穿过安装座上的孔后插入推杆头上的凹槽；所述的3d压印模具的制备材料为生物相容性光固化树脂。
9、制备肝小叶膜片时，将培养的肝细胞片加入印模主体中，将推拉装置和推杆头组装成的活动单元从印模主体的安装座一端向另一端推进，在印模主体中压印成具有六边形中空横截面的肝小叶膜片；将若干个肝小叶膜片逐层压印时，将肝小叶膜片堆叠后置于印模主体内，用活动单元在印模主体内推进挤压。
10、本专利技术还保护所述方法制备的仿生肝小叶。
11、本专利技术还保护所述的仿生肝小叶在药物筛选中的应用，将药物输送至仿生肝小叶，根据仿生肝小叶的反应情况进行药物筛选。
12、本专利技术还保护所述的仿生肝小叶在药物筛选中的应用，将制备的仿生肝小叶与多通道浓度梯度芯片相连接，多通道浓度梯度芯片的浓度梯度模块的各药物出口通道分别连接至一个独立的仿生肝小叶，构建成肝脏芯片；由药物出口通道流出的药液灌注至仿生肝小叶后的反应情况进行药物筛选。
13、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
14、本专利技术的研究包括，通过3d压印技术构建肝小叶结构功能单元，制备多层、多尺度仿生肝小叶样细胞片的仿生肝小叶，多层仿生肝小叶结构的功能验证，肝脏芯片的构建，研究构建的仿生肝小叶结构在治疗急性肝衰竭中的作用。
15、本专利技术使用所研发的3d压印模具，将正常培养的肝细胞材料雕刻成六边形中空横截面。通过逐层的压印，该装置最终可在垂直方向上推出一定高度、细胞密度高、相互作用完整的3d肝小叶组件；将血管内皮细胞浸润到3d肝小叶组件的六角星柱状的中空管腔中，可以实现具有血管化通道的仿生肝小叶，用于营养物质扩散和药物灌注；基于血管化仿生肝小叶，将其整合到微流控芯片中，形成了芯片上的肝脏，并展示了其用于药物筛选的功能。
16、本专利技术制备的仿生肝小叶与真实的肝小叶(以中央静脉为中心，肝板、肝血窦围绕中央静脉呈辐射状分布)有相似的结构和功能；本专利技术还创新的模拟人肝脏的细胞组成，组装了hipsc-heps、巨噬细胞和肝星状细胞(hscs)的比例分别为22.23％、9.88％和0.65％的肝小叶膜片。为了实现对单个立体肝小叶的空间和组成的模拟；本专利技术制备的仿生肝小叶还可以进行宏观放大。
17、研究结果表明，本专利技术的3d仿生肝小叶可为药物筛选提供新的方法，并在临床肝脏组织工程中显示出显著的潜力。
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1.一种仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：采用3D压印模具将培养的肝细胞片雕刻成具有六边形中空横截面的肝小叶膜片，通过3D压印模具使雕刻的若干个肝小叶膜片逐层压印，并在其中浸润血管内皮细胞，形成具有一定高度、细胞密度及仿生功能的仿生肝小叶。
2.根据权利要求1所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：肝细胞片中的肝细胞为iPSCs-Hep，将肝细胞接种到温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿上，在常规贴壁条件下培养生成肝细胞片。
3.根据权利要求2所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：当温度从37℃降低至20℃时，培养的肝细胞片从温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿上分离。
4.根据权利要求1所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：逐层压印的肝小叶膜片在体外培养1-4小时后各层肝小叶膜片间逐渐融合；在仿生肝小叶中空的中间管腔内灌注人脐静脉内皮细胞。
5.根据权利要求2所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：在肝细胞培养时还加入巨噬细胞和肝星状细胞，在温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿中将hiPSC-Heps、巨噬细胞和肝星状细胞按比例混合培养；
6.根据权利要求1所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：所述的3D压印模具包括印模主体、推拉装置和推杆头；所述的印模主体包括横截面为正六边形的筒体、内置于筒体中的六角星形实心柱体，所述实心柱体一端与筒体通过安装座固定相连，所述的安装座上分布有三个孔；所述的推拉装置包括推拉盘和固定在推拉盘上的三根圆柱杆，所述推拉盘具有六角星形镂空结构；所述的推杆头上分布有三个圆形凹槽；推拉装置和推杆头组装时，推拉装置的圆柱杆分别从印模主体的六角星形实心柱体周围间隔的穿过，推拉盘的六角星形镂空结构穿过印模主体的六角星形实心柱体，推拉盘的圆柱杆穿过安装座上的孔后插入推杆头上的凹槽；所述的3D压印模具的制备材料为生物相容性光固化树脂。
7.根据权利要求6所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：制备肝小叶膜片时，将培养的肝细胞片加入印模主体中，将推拉装置和推杆头组装成的活动单元从印模主体的安装座一端向另一端推进，在印模主体中压印成具有六边形中空横截面的肝小叶膜片；将若干个肝小叶膜片逐层压印时，将肝小叶膜片堆叠后置于印模主体内，用活动单元在印模主体内推进挤压。
8.权利要求1-7任一项所述方法制备的仿生肝小叶。
9.权利要求8所述的仿生肝小叶在药物筛选中的应用，其特征在于：将药物输送至仿生肝小叶，根据仿生肝小叶的反应情况进行药物筛选。
10.根据权利要求9所述的仿生肝小叶在药物筛选中的应用，其特征在于：将制备的仿生肝小叶与多通道浓度梯度芯片相连接，多通道浓度梯度芯片的浓度梯度模块的各药物出口通道分别连接至一个独立的仿生肝小叶，构建成肝脏芯片；由药物出口通道流出的药液灌注至仿生肝小叶后的反应情况进行药物筛选。
...【技术特征摘要】
1.一种仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：采用3d压印模具将培养的肝细胞片雕刻成具有六边形中空横截面的肝小叶膜片，通过3d压印模具使雕刻的若干个肝小叶膜片逐层压印，并在其中浸润血管内皮细胞，形成具有一定高度、细胞密度及仿生功能的仿生肝小叶。
2.根据权利要求1所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：肝细胞片中的肝细胞为ipscs-hep，将肝细胞接种到温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿上，在常规贴壁条件下培养生成肝细胞片。
3.根据权利要求2所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：当温度从37℃降低至20℃时，培养的肝细胞片从温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿上分离。
4.根据权利要求1所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：逐层压印的肝小叶膜片在体外培养1-4小时后各层肝小叶膜片间逐渐融合；在仿生肝小叶中空的中间管腔内灌注人脐静脉内皮细胞。
5.根据权利要求2所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：在肝细胞培养时还加入巨噬细胞和肝星状细胞，在温度响应性聚合物嫁接的细胞培养皿中将hipsc-heps、巨噬细胞和肝星状细胞按比例混合培养；hipsc-heps、巨噬细胞和肝星状细胞的混合比例以百分质量比计分别为67.86％、30.16％和1.98％。
6.根据权利要求1所述的仿生肝小叶的制备方法，其特征在于：所述的3d压印模具包括印模主体、推拉装置和推杆头；所述的印模主体包括横截面为正六边形的筒体、内置于筒体中的六...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵远锦，王经琳，任昊桢，黄丹青，
申请(专利权)人：南京鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：
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