高通量筛选sirtuin突变体的方法及sirtuin突变体和其应用技术

本发明专利技术涉及一种高通量筛选sirtuin突变体及其筛选方法和应用。该sirtuin突变体的筛选方法，包括如下步骤：采用易错PCR技术构建sirtuin突变体库；裂解所述sirtuin突变体库中各突变体，固液分离，收集裂解上清液；采用AMC荧光法测定所述裂解上清液的sirtuin去酰基化活性，获得所需去去酰基化活性的sirtuin突变株。采用上述sirtuin突变体的筛选方法，能够简便、高通量、可重复的筛选到去酰基化酶sirtuin突变体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，特别是涉及一种高通量筛选sirtuin突变体的方法及sirtuin突变体和其应用。

技术介绍

1、sirtuin是一类以nad+为底物的蛋白去酰基化酶，广泛存在于细菌、古菌和真核生物三域生命系统，参与调控了基因转录、染色体分离、rna剪切、细胞代谢、细胞凋亡、能量代谢等一系列重要的生物学进程。除了去乙酰化酶活，sirtuin还被报道具有其他酶活性，如去琥珀酰化、去肉豆蔻酰化和去壬酰基化酶活等。

2、sirtuin去酰基化调控与肥胖、衰老、癌症、神经退行性病变以及心血管疾病等密切相关。近年来，sirtuin在不同物种，如人，酵母和大肠杆菌中的晶体结构相继被解析。然而，由于缺乏对sirtuin酶活分子机制的系统性了解，sirtuin去酰基化酶活的关键调控位点目前并不完全清楚。而且，迄今为止也未有靶向sirtuin的药物获批上市。究其原因，很大一方面是由于缺乏一种针对sirtuin酶活的高效、准确的检测方法。目前，sirtuin酶活检测方法主要有同位素标记法、免疫印迹法、高效液相色谱法和荧光法。其中，同位素标记法由于操作繁琐和潜在本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，采用初始sirtuin构建所述sirtuin突变体库，所述初始sirtuin基因包括连接的关键区域片段和非关键区域片段，采用易错PCR构建所述sirtuin突变体库的步骤包括：

3.根据权利要求2所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，采用第一引物对进行易错PCR，所述第一引物对的序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求2所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，所...

【技术特征摘要】

1.一种sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，采用初始sirtuin构建所述sirtuin突变体库，所述初始sirtuin基因包括连接的关键区域片段和非关键区域片段，采用易错pcr构建所述sirtuin突变体库的步骤包括：

3.根据权利要求2所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，采用第一引物对进行易错pcr，所述第一引物对的序列如seq id no.1～seq id no.2所示。

4.根据权利要求2所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，所述以表达载体的质粒为模板并在高保真酶的作用下进行pcr扩增的步骤中，采用第二引物对进行pcr扩增，所述第二引物对的序列如seq id no.3～seq id no.4所示。

5.根据权利要求2所述sirtuin的突变体的筛选方法，其特征在于，以目前控制的1-4个碱基/kb突变频率下计算，构建10倍覆盖率的突变体库，可以筛选到sirtuin关键区域的氨基酸位点，其中，所述突变体库有2,000个-6,000个克隆。

6.根据权利要求1所述的sirtuin突变体的筛选方法，其特征在于，裂解所述sirtuin突变体库中各突变体的步骤中，采用细胞裂解液进行裂解，所述细胞裂解液包括：非变性去垢剂、ph7～8的缓冲液，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵维，邹思维，蔡可祝，杨玉蛟，赵国屏，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：