【技术实现步骤摘要】
本公开涉及用于测定酶和代谢产物的组合物、方法和试剂盒。
技术介绍
1、荧光素是外消旋化合物，在溶液中，其由d-荧光素外消旋至l-荧光素或者由l-荧光素外消旋至d-荧光素。d-荧光素可以用作荧光素酶的底物而产生光，而l-荧光素很大程度上是抑制性的并且导致发光减少。由于d-荧光素底物的可用性的变化和降低以及l-荧光素的抑制作用，在储存过程中d-荧光素至l-荧光素的缓慢外消旋对于利用荧光素酶活性的测定存在问题。
技术实现思路
1、在某些实施方案中，提供了包含荧光素酶、l-荧光素和d-荧光素的组合物，其中所述组合物基本上不含atp。在某些实施方案中，提供了包含atp、l-荧光素和d-荧光素的组合物，其中所述组合物基本上不含荧光素酶。
2、在一些实施方案中，提供了包含d-荧光素、l-荧光素和atp的组合物。
3、在某些实施方案中，提供了包含荧光素酶、l-荧光素和d-荧光素和atp的组合物，其中所述l-荧光素的浓度超过所述d-荧光素的浓度。
4、在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含荧光素酶、l-荧光素和d-荧光素，所述组合物基本上不含atp且包装在容器中。所述试剂盒可以包括至少一种额外组分，例如一种或多种洗涤剂，例如十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷，磷酸钾、消泡剂、缓冲剂、盐和螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)。
5、在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含d-荧光素、l-荧光素和atp，其中所述l-
6、在一些实施方案中，提供了包含组合物的试剂盒，所述组合物包含l-荧光素、d-荧光素和atp，所述组合物基本上不含荧光素酶且包装在容器中。所述试剂盒可以包括至少一种额外组分，例如缓冲剂、二价阳离子螯合剂、镁盐、离子型或非离子型洗涤剂、含硫醇化合物，如辅酶a或dtt、一种或多种含硫还原剂或其组合。
7、在一些实施方案中，提供了用于测定样品中atp的存在或量的方法，其中使包含荧光素酶、l-荧光素和d-荧光素的组合物与样品接触并检测和/或测量产生的发光度以测定样品中atp的存在或量。
8、在一些实施方案中，提供了用于测定样品中荧光素酶的存在或量的方法、试剂盒或组合物，其中使包含d-荧光素、l-荧光素和atp的组合物与样品接触，所述样品可以含有表达荧光素酶的细胞。然后检测和/或测量产生的发光度以测定样品中荧光素酶的存在或量。含有表达荧光素酶的细胞的样品可以是裂解的细胞、未加工的细胞提取物或澄清的细胞提取物。
9、在一些实施方案中，提供了用于检测来自表达荧光素酶的细胞的荧光素酶活性的方法，其中荧光素酶在细胞中表达，并且使所述细胞与包含l-荧光素和d-荧光素的混合物接触，在所述混合物中所述l-荧光素与所述d-荧光素的比率为至少约5:95至约75:25。在一些实施方案中，所述混合物包含l-荧光素和d-荧光素，所述l-荧光素和所述d-荧光素的比率为至少约5:95至约55:45，或至少约5:95至约50:50。然后检测和/或测量产生的发光度以测定细胞中荧光素酶的存在或量。
10、在一些实施方案中，提供了用于检测或定量细胞或其他样品中核苷磷酸例如atp或atp源的方法，其中使所述细胞或样品与包含l-荧光素和d-荧光素的混合物和荧光素酶接触，在所述混合物中所述l-荧光素与所述d-荧光素的比率为至少约0.5:1至约2:1。然后检测和/或测量产生的发光度以测定细胞中核苷磷酸的存在或量。
11、在一些实施方案中，提供了用于进行荧光素酶反应的方法。将包含l-荧光素和d-荧光素的混合物在约0℃至约35℃的温度下储存一定时间段。当在荧光素酶活性测定中使用所述混合物时，测量了光输出，即发光度。允许所述混合物与含有或表达荧光素酶，atp或atp源的样品或部分样品接触，以形成反应测定物。然后检测反应测定物中产生的发光度。已经储存一定时间段的含有混合物的反应测定物产生光输出，在某些实施方案中，所述光输出为在储存时间段开始时(时间t＝0)含有所述混合物的可比较的反应测定物的光输出的至少约50％或至少约90％。在某些实施方案中，储存时间段可能为至少约30分钟，至少约1小时，至少约4小时或更长。
12、在一些实施方案中，提供了用于配制用于荧光素酶反应的组分的方法。使d-荧光素和l-荧光素合并以形成混合物，所述混合物在约0℃至约35℃的温度下储存一定时间段，如约1、2、3或4小时或1周或2周的时间段。当在荧光素酶活性测定中使用时，所述混合物允许产生光输出，即发光度，以致在所述时间段之后产生的光输出为在所述时间段开始时的光输出的至少约50％或至少约90％。
13、本公开涉及包含荧光素酶、l-荧光素和d-荧光素的组合物。所述组合物基本上不含atp。所述组合物可以包含至少约0.5:1至约2:1的l-荧光素与d-荧光素的比率。所述组合物可以包含至少约5:95至约55:45的l-荧光素与d-荧光素的比率。所述组合物可以具有至少约5且小于约9的ph。所述荧光素酶可以是甲虫荧光素酶，如萤火虫荧光素酶或叩头虫荧光素酶。d-荧光素可以是d-5'氟荧光素且l-荧光素是l-5'氟荧光素。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐、amp、辅酶a、还原剂或其组合。所述组合物可以包含硫酸镁和反式-1,2-环己二胺四乙酸(cdta)。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的额外组分：1,4-哌嗪二乙磺酸、1,2-二氨基环己烷四乙酸、tergitol洗涤剂、mazu消泡剂、硫酸镁、atp、辅酶a、焦磷酸盐、dtt、亚硫酸盐和硫代硫酸盐。所述组合物还可以包含至少一种选自如下的组分：氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾、乙二胺四乙酸(edta)和amp。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少两种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少三种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少四种。所述组合物可以包含所述额外组分中的至少五种。所述组合物还可以包含镁离子、柠檬酸缓冲剂、mes缓冲剂、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、焦磷酸盐、磷酸钾和乙二胺四乙酸(edta)。所述组合物还可以包含柠檬酸缓冲剂、hepes缓冲剂、镁离子、乙二胺四乙酸(edta)、磷酸钾、消泡剂、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷和amp。与未包含l-荧光素的组合物相比，当在约0℃至约35℃之间的温度下储存时，所述组合物可以具有增加的储存寿命和/或稳定性。
14、本公开涉及包含d-荧光素、l-荧光素和atp的组合物。所述组合物基本上不含荧光素酶。所述组合物可以包含至少约0.5:1至约2:1的l-荧光素与d-荧光本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测荧光素酶活性的荧光素酶反应组合物，其包含(a)一定浓度的L-荧光素和一定浓度的D-荧光素的混合物，以及(b)三磷酸腺苷(ATP)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述L-荧光素的浓度超过所述D-荧光素的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述L-荧光素的浓度与所述D-荧光素的浓度以以下比率存在于所述混合物中：至少小于约2:1；至少约0.5:1至约2:1；至少约5:95至约55:45；至少约5:95至约75:25；至少约5:95至约50:50；至少约5:95至约25:75；或至少约5:95至约20:80。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中与包含D-荧光素且无L-荧光素的混合物相比，所述一定浓度的D-荧光素和一定浓度的L-荧光素的混合物增加发光信号的半衰期。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物在22℃的温度下储存至少1天后保留至少约50％的荧光素酶活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述混合物中L-荧光素的量和/或D-荧光素的量为以
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含荧光素酶。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述混合物的pH值为约5至约9、约6.5至约7.8或约6.6至约6.8。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述D-荧光素是D-5’氟荧光素。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述L-荧光素是L-5’氟荧光素。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自如下的额外组分：缓冲剂、蛋白质稳定剂、镁离子、金属螯合剂、洗涤剂、消泡剂、无机磷酸盐、焦磷酸盐、AMP、辅酶A、还原剂或以上的任意组合。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自如下的额外组分：1,4-哌嗪二乙磺酸、1,2-二氨基环己烷四乙酸、Tergitol洗涤剂、Mazu消泡剂、硫酸镁、辅酶A、焦磷酸盐、DTT、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、氟化钠、十二烷基三甲基铵、羟基聚乙氧基十二烷、消泡剂、磷酸钾、乙二胺四乙酸(EDTA)、AMP、反式-1,2-环己二胺四乙酸(CDTA)或以上的任意组合。
13.试剂盒，其包含权利要求1至12中任一项所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其还包含荧光素酶。
15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，其还包含一种或多种选自如下的额外组分：缓冲剂、无机磷酸盐、螯合剂、消泡剂、盐、洗涤剂、含硫醇化合物、含硫还原剂或以上的任意组合。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测荧光素酶活性的荧光素酶反应组合物，其包含(a)一定浓度的l-荧光素和一定浓度的d-荧光素的混合物，以及(b)三磷酸腺苷(atp)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述l-荧光素的浓度超过所述d-荧光素的浓度。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述l-荧光素的浓度与所述d-荧光素的浓度以以下比率存在于所述混合物中：至少小于约2:1；至少约0.5:1至约2:1；至少约5:95至约55:45；至少约5:95至约75:25；至少约5:95至约50:50；至少约5:95至约25:75；或至少约5:95至约20:80。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中与包含d-荧光素且无l-荧光素的混合物相比，所述一定浓度的d-荧光素和一定浓度的l-荧光素的混合物增加发光信号的半衰期。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述组合物在22℃的温度下储存至少1天后保留至少约50％的荧光素酶活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述混合物中l-荧光素的量和/或d-荧光素的量为以下中的至少一种：约1nm、约5nm、约10nm、约50nm、约100nm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约25μm、约50μm、约100μm、约250μm、约0.5mm或约1mm。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含荧光素酶。
...【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔·P·瓦利，詹姆士·J·卡利，布洛克·宾考斯基，克里斯多弗·托德·艾格斯，基思·V·伍德，
申请(专利权)人：普洛麦格公司，
类型：发明
国别省市：
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