【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病害快速诊断领域，涉及一种环介导等温扩增技术，特别是番茄髓部坏死病的快速检测方法。
技术介绍
1、番茄是世界主要蔬菜和经济作物之一，番茄病害种类多、危害重，极大地制约了番茄产业的发展。番茄髓部坏死病，是番茄栽培上严重影响产量的一类重要病害。该病害在全球范围内均有发生，巴西、意大利、美国、墨西哥、沙特阿拉伯都是该病发生的主要分布地。在国内，广东省、浙江省、山东省、江苏省，上海、湖北省、湖南省、河北省、山西省、福建省等对各地的番茄髓部坏死病的发生状况，栽培设施和种植模式等进行了多方面的报道，番茄髓部坏死病对产业带来了巨大的威胁。
2、已报道的番茄髓部坏死病病原菌中，明确引起病症的有绿黄假单胞菌(pseudomonas viridiflava)，皱纹假单胞菌(pseudomonas corrugata)，菊苣假单胞菌(pseudomonas cichori)。其中，按照冯晓晓,施斌,陈恩磊等“番茄髓部坏死病病原菌分离鉴定及药剂筛选[j].实验技术与管理,2023,40(03):14-20.doi:10.16791/j.cnki.sjg.2023.03.003”的文章告知绿黄假单胞菌(pseudomonas viridiflava)代表菌株为zjup0398-2(冯晓晓等)，皱纹假单胞菌(pseudomonas corrugata)代表菌株为cgmcc1.3068，菊苣假单胞菌(pseudomonas cichori)代表菌株为cgmcc 1.4934。番茄细菌性髓部坏死症状包括番茄植株叶片有v形侵入，失绿变黄
3、在番茄生产上，青枯病也是引起重大损失的病害，其病原菌是β-变形菌纲的茄科雷尔氏菌，简称青枯病菌(ralstonia solanacearum)。青枯病菌主要随病残体在土壤中越冬，从根部或茎基部伤口或自然孔口侵入，在根部皮层定殖，随后侵入木质部导管，并沿着植物木质部导管蔓延扩散，导致植株出现萎蔫、维管束褐变、直至整株枯死。
4、仅靠田间症状，番茄髓部坏死病和青枯病常容易混淆。常规的选择性分离技术，需要进行纯培养和生化鉴定等多个步骤，检测周期长，灵敏性低，不能实现大批量植物组织的快速检测，通常要花费3天以上时间，两者在显微镜均有喷菌现象。近年来发展的pcr技术虽能提高检测效率,但是需要专用pcr仪和专业操作人员和电泳观测结果，在基层农业部门难以大规模推广应用。lamp技术是2000年notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在bst dna聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件lh内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到多拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。lamp方法与pcr技术相比，检测时间短，具有更高的灵敏度和特异性,操作简单。
5、番茄是全球重要的蔬菜作物之一，在中国有着广泛的种植。番茄髓部坏死病对番茄生产造成了严重威胁，因此迫切需要一种高效、便捷的病原检测方法，以帮助农民及时采取控制措施，减少产量损失。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速、特异好、灵敏高的利用环介导等温扩增检测番茄髓部坏死病的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测番茄髓部坏死病。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种用于快速检测番茄髓部坏死病的引物，包括以下引物组：内引物对和环引物对：
3、内引物对：
4、上游内引物fip(5'-3'):cgtctgaagtcaaaaccgccgt-gggttttccagcaggaagt；下游内引物bip(5'-3'):accagcttgtctttggtctgcg-tgacagcgatcatctccgtt；
5、环引物对：
6、环引物lf(5'-3'):acaagagatgggtaaatacttctcg；
7、环引物lb(5'-3'):agctgaacttgggatcggg。
8、作为本专利技术的用于快速检测番茄髓部坏死病的引物的改进：还包括外引物对：
9、外引物对：
10、上游外引物f3(5'-3'):ttgccgacaacagccttg；
11、下游外引物b3(5'-3'):gtgacgatgcgcgtgaag。
12、本专利技术还同时提供了一种快速检测番茄髓部坏死病的试剂盒，利用如上所述引物；
13、包括标准反应缓冲液、l-hnb变色指示剂、mg2+、dntp、bst 4.2dna/rna聚合酶、引物组及模板。
14、本专利技术还同时提供了一种快速检测番茄髓部坏死病的方法：利用如上所述引物；
15、设定25μl反应体系为：标准反应缓冲液2.5μl、l-hnb变色指示剂1μl、mg2+4μl、dntp2.5μl、bst 4.2dna/rna聚合酶0.5μl、引物组2.5μl、模板1μl、dd h2o 11μl；
16、所述引物组由内引物对和环引物对组成；或者引物组由内引物对、外引物对和环引物对组成；
17、65℃～70℃反应30～60min；
18、当反应结果不变色，仍然为紫罗兰色时，模板为阴性；
19、反之，当反应结果变色(呈现绿色)时，模板为阳性。
20、说明：绿色包括偏绿色、浅绿色或黄绿色等绿色系颜色，以下同。
21、作为本专利技术的快速检测番茄髓部坏死病的方法的改进，反应体系中：
22、引物组fip/bip浓度为8μm，lf/lb浓度为4μm；
23、或者：
24、引物组fip/bip浓度为16μm，lf/lb浓度为4～8μm，f3/b3浓度为2μm。
25、作为本专利技术的快速检测番茄髓部坏死病的方法的进一步改进：
26、反应体系中的模板为以下任一(即，检测对象如如下任一)：植物组织或者细菌培养物(来自番茄的菌液)或者细菌基因组dna；
27、当模板为阴性时，判定植物组织，或者来自番茄的菌液或者基因组dna没有感染番茄髓部坏死病，即，植物组织或者细菌培养物或者细菌基因组dna不含番茄髓部坏死病病原菌；
28、当模板为阳性时，则判定植物组织，或者来自番茄的菌液或者基因组dna感染了番茄髓部坏死病。
29、作为本专利技术的快速检测番茄髓部坏死病的方法的进一步改进，
30、番茄髓部坏死病的病原菌包括绿黄假单胞菌(pseudomonas viridiflava)，皱纹假单胞菌(pseudomonas corrugata)，菊苣假单胞菌(pseudomonas cichori)中的至少任一(即，为任一或其任意组合)。
31、作为本专利技术的快速检测番茄髓部坏死病的方法的进一步改进，
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【技术保护点】
1.用于快速检测番茄髓部坏死病的引物，其特征是包括以下引物组：内引物对和环引物对：
2.根据权利要求1所述的用于快速检测番茄髓部坏死病的引物，其特征是：还包括外引物对：
3.一种快速检测番茄髓部坏死病的试剂盒，其特征是：利用如权利要求1或2所述引物；
4.一种快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是：利用如权利要求1或2所述引物；
5.根据权利要求4所述的快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是反应体系中：
6.根据权利要求4或5所述的快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是：
7.根据权利要求4～6任一所述的快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是：番茄髓部坏死病的病原菌包括绿黄假单胞菌(Pseudomonas viridiflava)，皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)，菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichori)中的至少任一。
8.根据权利要求4～7任一所述的快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是：优选反应条件为70℃反应30min。
【技术特征摘要】
1.用于快速检测番茄髓部坏死病的引物，其特征是包括以下引物组：内引物对和环引物对：
2.根据权利要求1所述的用于快速检测番茄髓部坏死病的引物，其特征是：还包括外引物对：
3.一种快速检测番茄髓部坏死病的试剂盒，其特征是：利用如权利要求1或2所述引物；
4.一种快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是：利用如权利要求1或2所述引物；
5.根据权利要求4所述的快速检测番茄髓部坏死病的方法，其特征是反应体系中：
6.根据权利要...
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