【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物发酵合成领域，特别涉及以海藻寡糖为底物合成5-ala的生物合成方法。
技术介绍
1、5-ala是一种生物体内天然存在的高附加值非蛋白质氨基酸，可被广泛应用在农业、饲料、医药、化工等领域内，市场需求量逐年增加。目前5-ala主要通过化学合成法生产，其成本较高，环境问题突出，导致5-ala价格居高不下，限制了其在各领域的大规模应用。通过绿色安全的生物发酵法合成5-ala逐渐成为近年来研究的热点。
2、5-ala的生物合成主要存在两条途径：一条是以琥珀酸、甘氨酸为底物称为c4途径，另一条是以谷氨酸为底物称为c5途径。c4途径是由5-alas催化琥珀酰-coa和甘氨酸生成5-ala。c5途径是以谷氨酸为底物经过三步酶促反应生成5-ala。在5-ala合成过程中，c4、c5途径都以葡萄糖为前体，经三羧酸循环转化为谷氨酸和甘氨酸，进而形成5-ala。
3、目前5-ala在生物发酵合成过程中直接以大量葡萄糖为底物，大大增加了经济成本，造成资源浪费。能否利用成本更低的底物原料，通过关键酶的表达优化和发酵体系的构建，实现5-ala的大量合成，建立一条安全、高效、低成本的生物法合成5-ala的新路线，成为亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，其包括如下的步骤：
2、s1、将含有褐藻多糖或绿藻多糖的原料利用酶降解为含有若
3、s2、菌种活化：挑取一环谷氨酸棒状杆菌菌苔接种于种子活化培养基进行活化；
4、s3、种子液制备：将谷氨酸棒状杆菌菌苔，接种于种子培养基中制得种子液；
5、s4、上罐发酵：将海藻寡糖和抗生素加入到含有发酵培养基的发酵罐中发酵；
6、s5、将种子液接种到发酵罐进行发酵；
7、s6、当发酵过程中od600达到30-50时，加入诱导剂和甘氨酸，补加褐藻寡糖或绿藻寡糖，以甘氨酸作为底物进行诱导合成5-ala；
8、s7、放料：调节发酵罐中物质的ph至1-5，经升温、保温、冷却后放料。
9、优选地，步骤s1中，所述褐藻寡糖或绿藻寡糖含有的单糖为l-岩藻糖、d-木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、d-乙醇醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸中的一种或多种。
10、优选地，步骤s2中，种子活化培养基含有：
11、酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，于121℃，湿热灭菌20min，抗生素50ppm；
12、具体步骤为：
13、从在4℃保存的菌种斜面上挑取一环谷氨酸棒状杆菌菌苔，接种于种子活化培养基，三区划线，28-35℃待菌落生长18-24h，挑取形态一致单菌落于试管斜面进行二次传代，28-35℃待菌落生长18-24h。
14、优选地，步骤s3中，种子培养基含有：
15、过滤除菌后加入的磷酸氢二钾3g/l，磷酸二氢钾3g/l，氯化钠0.5g/l，氯化铵1g/l，葡萄糖40g/l，硫酸镁2g/l，氯化钙0.001g/l，酵母粉5g/l，尿素5g/l，微量元素，抗生素50ppm；
16、具体步骤为：
17、保持温度28-35℃，摇床180-240rpm，培养18-24h，待od600达到10-30转接发酵罐。
18、优选地，步骤s4中，发酵培养基含有：
19、氯化铵5-8g/l，蛋白胨2-4g/l，kh2po45-15g/l，feso4·7h2o0.2-0.02g/l混合后121℃、20min灭菌；
20、具体过程包括：
21、将经过115℃、20min单灭的褐藻寡糖或绿藻寡糖，过滤除菌的抗生素50ppm，加入到发酵罐，按照装液量45-65％，降温到30-35℃，加入氢氧化钠调节ph为6.0-7.0。
22、优选地，步骤s5的具体过程包括：种子液接种量为5％-10％，于30℃培养30-50h，初始转速300rpm，初始通气量0.6-1.2：1vvm，最高通气量为1.2vvm。
23、优选地，步骤s6，诱导剂选用iptg，即异丙基-β-d-硫代半乳糖苷。
24、优选地，步骤s7的具体过程包括：加入磷酸、柠檬酸、盐酸、醋酸中的一种或多种，调节ph为1-5；升温到80-100℃，保温15-30min，后冷却。
25、优选的方案中，步骤s1中，含有绿藻多糖的原料采用石莼；含有褐藻多糖的原料采用大叶海藻、羊栖菜、裙带菜、墨角藻中的一种或多种。
26、本专利技术所达到的有益效果为：
27、本专利技术提供的以海藻寡糖为底物进行微生物发酵合成5-ala，因绿藻寡糖和褐藻寡糖中单体种类的多样性，以及结构有机结合，显著增加5-ala发酵产量与应用效果，具体表现在：
28、本专利技术将含有褐藻多糖或绿藻多糖的原料作为寡糖提取物，其中含有种类、分子量、支化程度各异的单糖，不同的结合程度与结合方式，增加了发酵液中5-ala的含量，因而增加了其转色效果；寡糖作为前体与甘氨酸底物协同作用增加了5-ala转化可能性，因而增加了产量。
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1.一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于，其包括如下的步骤：
2.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S1中，所述褐藻寡糖或绿藻寡糖含有的单糖为L-岩藻糖、D-木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、D-乙醇醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S2中，种子活化培养基含有：
4.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S3中，种子培养基含有：
5.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S4中，发酵培养基含有：
6.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S5的具体过程包括：种子液接种量为5％-10％，于30℃培养30-50h，初始转速300rpm，初始通气量0.6-1.2：1vvm，最高通气量为1.2vvm。
7.根据
8.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S7的具体过程包括：加入磷酸、柠檬酸、盐酸、醋酸中的一种或多种，调节PH为1-5；升温到80-100℃，保温15-30min，后冷却。
9.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ALA的方法，其特征在于：步骤S1中，含有绿藻多糖的原料采用石莼；含有褐藻多糖的原料采用大叶海藻、羊栖菜、裙带菜、墨角藻中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，其特征在于，其包括如下的步骤：
2.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，其特征在于：步骤s1中，所述褐藻寡糖或绿藻寡糖含有的单糖为l-岩藻糖、d-木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、d-乙醇醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，其特征在于：步骤s2中，种子活化培养基含有：
4.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，其特征在于：步骤s3中，种子培养基含有：
5.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-ala的方法，其特征在于：步骤s4中，发酵培养基含有：
6.根据权利要求1所述的一种以海藻寡糖为底糖生物合成5-a...
【专利技术属性】
技术研发人员：王法国，刁红霞，宋海妹，邓德法，单俊伟，
申请(专利权)人：青岛海大生物集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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