【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷d的方法，属于生物催化合成领域。
技术介绍
1、由于高热量糖类的过量摄入导致世界范围内严重的过度肥胖、糖尿病、高血压和心脑血管等疾病。因此，来自甜叶菊的甜菊糖苷类化合物因其甜度高、热量低且安全性高而受到广泛关注。其中，含量较为丰富的甜菊糖、莱鲍迪苷a等作为甜味剂已广泛应用于饮料、食品等领域。它们具有相较于蔗糖250-300倍的甜度，但是口感上存在甜味之外的苦后味严重影响它们作为甜味剂的口感。而在甜菊糖苷中含量较少的莱鲍迪苷d(reb d)相较于莱鲍迪苷a(reb a)和甜菊糖具有更高的甜度，并且减少了甜味之外的苦后味而因此作为甜味剂具有更好的口感，被认为是非常具有潜力的下一代甜味剂。然而，reb d其在甜叶菊干叶中的含量仅为0.4％-0.5％，仅为reb a含量的十分之一左右，这也使得通过传统的叶片提取reb a的方法并不适用于reb d的提取。繁琐且复杂的提取方法使得仅从甜叶菊叶子中提取难以实现规模化生产，也难以满足市场需求。
2、目前，通过酶催化方法以甜叶菊中含量较高的reb a为底物催化合成reb d被认为是一种可行的提高reb d生产量的技术路线。通过相关科学家不断探索和挖掘，与以reb a为底物合成reb d相关的糖苷转移酶(eugt11、ugt91d2、ugtsl2)已被挖掘和鉴定。并且通过大肠杆菌等微生物实现这些糖基转移酶的异源表达和reb d的异源生物合成。然而，这些植物来源的糖苷转移酶在微生物中尤其是原核微生物中异源表达时主要以包涵体的形式存在且酶
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术挖掘来自枯草芽孢杆菌bs168的糖苷转移酶yojk催化reba合成reb d，该酶在大肠杆菌中能够实现可溶性高效表达，并且在尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)存在的情况下具有催化reb a合成reb d的活性。通过基于蛋白质结构的定向进化，成功获得高效突变体，并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖udpg循环体系，利用大肠杆菌裂解液实现高效生物合成reb d，为reb d生物合成提供一种新的方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种糖基转移酶突变体yojk-i241t/g327n，所述突变体yojk-i241t/g327n是在氨基酸序列登录号wp_004399256.1的糖基转移酶的基础上，将第241位的异亮氨酸突变为苏氨酸，将第327位的甘氨酸突变为天冬酰胺。
4、本专利技术的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶的基因。
5、本专利技术的第三个目的是提供携带编码上述糖基转移酶的基因的表达载体。
6、本专利技术的第四个目的是提供表达上述糖基转移酶的重组菌。
7、在一种实施方式中，所述重组菌还表达蔗糖合酶。
8、在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。
9、在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列的ncbi登录号为np_001031915。
10、在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。
11、本专利技术的第五个目的是提供一种催化合成莱鲍迪苷d的方法，所述方法为以reb a为底物，利用所述重组菌的细胞裂解液进行催化反应。
12、在一种实施方式中，所述细胞裂解液为所述重组菌诱导表达后进行细胞裂解获得的上清液。
13、在一种实施方式中，所述催化反应的条件为：以1-50mmol/l reb a、0-800mmol/l蔗糖、5-25％(v/v)dmso、100mmol/l k2hpo4-kh2po4缓冲液，100mmol/l nacl为反应体系，20-45℃糖基化反应0-48h。
14、在一种实施方式中，所述缓冲液ph为5.5-9.0。
15、本专利技术还保护上述糖基转移酶或上述基因或上述表达载体或上述微生物细胞或上述重组菌或上述方法在制备含有莱鲍迪苷d的产品中的应用。
16、有益效果：
17、(1)本专利技术将编码糖基转移酶yojk的核酸序列用于制备能够催化reb a生成reb d的重组蛋白，制备出的重组蛋白能够以udpg为糖基供体，使reb a为底物发生糖基化合成reb d。
18、(2)本专利技术将氨基酸序列登录号wp_004399256.1的糖基转移酶yojk的氨基酸序列进行定点突变，将第241位的异亮氨酸突变为苏氨酸，将第327位的甘氨酸突变为天冬酰胺，得到突变体yojk-i241t/g327n。在以udpg为糖基供体，突变体yojk-i241t/g327n显著提高催化reb a合成reb d的效率，催化活性大幅提升，相比野生型酶提高了7.35倍。
19、(3)本专利技术将编码糖基转移酶野生型yojk或突变体yojk-i241t/g327n的核苷酸序列与编码蔗糖合酶atsusy核苷酸序列连接至pacycduet-1构建重组质粒。通过偶联反应体系条件优化，实现利用19.32g/l(20mmol/l)reb a以91.29％的高产率合成20.59g/l的rebd。
20、(4)本专利技术构建的重组菌株共表达枯草芽孢杆菌来源的糖基转移酶突变体和拟南芥来源的蔗糖合酶，利用重组菌株诱导表达后制备得到的细胞裂解液催化reb a合成rebd，无需添加糖基供体，也不需要额外使用细胞通透剂，显著降低成本且绿色环保。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种糖基转移酶突变体YojK-I241T/G327N，其特征在于，所述突变体YojK-I241T/G327N是在氨基酸序列登录号WP_004399256.1的糖基转移酶的基础上，将第241位的异亮氨酸突变为苏氨酸，将第327位的甘氨酸突变为天冬酰胺。
2.编码权利要求1所述糖基转移酶的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述糖基转移酶的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还表达蔗糖合酶。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述蔗糖合酶的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_001031915。
8.一种催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于，以莱鲍迪苷A为底物，利用权利要求4～7任一所述重组菌的细胞裂解液进行催化反应。
9.根据权利要求8所述的一种催化合成莱鲍迪苷D的方法，其特征在于，所述催化反应的条件为：
10.权利要求1所述糖基转移酶或权利要求2所述基因或权利要求3所述表达载体或权利要求4～7任一所述重组菌或权利要求8或9所述方法在制备含有莱鲍迪苷D的产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶突变体yojk-i241t/g327n，其特征在于，所述突变体yojk-i241t/g327n是在氨基酸序列登录号wp_004399256.1的糖基转移酶的基础上，将第241位的异亮氨酸突变为苏氨酸，将第327位的甘氨酸突变为天冬酰胺。
2.编码权利要求1所述糖基转移酶的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.表达权利要求1所述糖基转移酶的重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还表达蔗糖合酶。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述...
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