【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶催化，具体涉及一种n-脱氧核糖转移酶在催化生产曲氟尿苷中的应用及其制备方法。
技术介绍
1、曲氟尿苷，又名三氟尿苷、三氟甲苷、三氟胸苷、三氟甲尿苷、三氟哩啶、三氟胸腺嘧啶核苷或5-三氟甲基-2-脱氧尿苷等，分子式为c10h11f3n2o5，是一类用于预防和治疗病毒感染的抗病毒药，对单纯疱疹病毒有抑制作用，其作用与碘苷相似。抗病毒机理可能是抑制某些dna酶活性或被胸苷激酶磷酸化为单磷酸、二磷酸和三磷酸化物，单磷酸化物能嵌入病毒dna，从而干扰dna的合成和病毒复制。现有医学研究表明，以曲氟尿苷为主要活性成分的药物还能够作为一种抗癌的核苷类药物，主要用于结直肠癌的治疗，特别是结肠癌患者的早期治疗上，曲氟尿苷能够直接和癌症的dna互相作用，使得dna不能正常行使功能，其作用机理与氟嘧啶、奥沙利铂和依立替康都不同，二期临床试验表明含有曲氟尿苷活性成分的药物对于以上三种药物都不能有效治疗的结肠癌患者有着不同的疗效。其化学结构如下式所示：
2、
3、目前制备曲氟尿苷主要有两类方法：一类方法为化学方法，另外一类方法为酶催化方法，例如申请号为cn01800828.3的专利在
技术介绍
部分提到，制备1-(2′-去氧-β-d-赤-戊呋喃糖基)-5-三氟甲基尿嘧啶衍生物的常规方法，包括了交换胸苷和5-三氟甲基尿嘧啶的核酸基，例如通过核苷-2′-脱氧核糖转移酶。然而本申请人在酶催化研究中发现并非所有脱氧核糖转移酶均能实现或高效地交换三氟甲基尿嘧啶和核苷底物上的碱基。
技术实现思路
1、为了能够高效替换核苷上的碱基，本专利技术提供了一种n-脱氧核糖转移酶的应用，将核苷上的碱基替换为尿嘧啶或其衍生物；所述n-脱氧核糖转移酶的氨基酸序列为seq idno.1。
2、本专利技术中的核苷，除了特殊说明外为核糖核苷或/和脱氧核糖核苷，由碱基与核糖或/和脱氧核糖缩合而成，其中碱基、核糖、脱氧核糖可以是未经过化学修饰的，也可以是经过化学修饰的。
3、所述n-脱氧核糖转移酶催化的摩尔转化率高于50％；在优选的催化条件下高于60％；在更优选的催化条件下高于70％。
4、优选地，将核苷上的碱基替换为三氟甲基尿嘧啶。
5、优选地，将脱氧核苷上的碱基替换为三氟甲基尿嘧啶。
6、优选地，将β-胸苷的碱基、或者脱氧胞苷的碱基、或者脱氧尿苷的碱基、或者脱氧腺苷的碱基、或者脱氧鸟苷的碱基替换为三氟甲基尿嘧啶。
7、本专利技术还提供了一种催化体系，包括氨基酸序列为seq id no.1的n-脱氧核糖转移酶；所述催化体系用于将核苷上的碱基替换为尿嘧啶或其衍生物。
8、优选地，所述催化体系用于将核苷上的碱基替换为三氟甲基尿嘧啶。
9、优选地，所述催化体系用于将脱氧核苷上的碱基替换为三氟甲基尿嘧啶。
10、优选地，所述催化体系用于将β-胸苷的碱基、或者脱氧胞苷的碱基、或者脱氧尿苷的碱基、或者脱氧腺苷的碱基、或者脱氧鸟苷的碱基替换为三氟甲基尿嘧啶。
11、优选地，所述n-脱氧核糖转移酶溶解在缓冲液中。
12、优选地，所述n-脱氧核糖转移酶溶解在磷酸缓冲液中。
13、本专利技术还提供了一种催化生产曲氟尿苷中的方法，包括在含有核苷底物和三氟甲基尿嘧啶的反应液中加入氨基酸序列为seq id no.1的n-脱氧核糖转移酶。
14、优选地，所述n-脱氧核糖转移酶、核苷底物、三氟甲基尿嘧啶溶解在缓冲液中。
15、对于在反应液中加入的酶，其可以根据本专利技术提供的氨基酸序列设计表达的工程菌，涉及和构建的方法对于本淋雨技术人员而言是已知的，并不需要付出创造性的劳动。加入酶的方式，可以是经过纯化的酶，例如将含有酶的发酵液，经过提取、分离得到其中的酶后加入反应液中；或者，为了简化提纯步骤、降低生产成本，将含有酶的发酵液或含有酶的发酵液粗提产物或含有酶的菌体直接加入反应液中。
16、优选地，所述核苷底物为β-胸苷或/和脱氧胞苷或/和脱氧尿苷或/和脱氧腺苷或/和脱氧鸟苷。
17、优选地，将核苷底物和三氟甲基尿嘧啶溶解在水或磷酸盐缓冲液中。
18、优选地，核苷底物/三氟甲基尿嘧啶投料当量比0.5:1～5:1，或1:1-2:1。
19、优选地，核苷底物浓度为10～100g/l，或20～80g/l，或40-60g/l。
20、优选地，反应液温度为40～60℃，或40～50℃，或45～55℃。
21、优选地，催化时间不少于1h，或不少于2h，或不少于3h，或不少于4h，或不少于5h。
22、优选地，催化反应包括ph控制。
23、优选地，使用磷酸缓冲液配制成反应液。
24、优选地，反应液的ph为5.0～8.0，或5.5～8.0，或5.5～7.5，或5.5～7.0，或5.0～7.5，或5.0～7.0，或5.5，或6.0，或6.5，或7.0，或7.5，或8.0。
25、本专利技术的有益效果在于：所述n-脱氧核糖转移酶催化的摩尔转化率高于50％，催化效率高，在规模化成产中可以有效提高产率以及降低生产成本。此外，所述酶的催化反应可以适应不同的核苷底物，对核苷底物上的不同碱基均能实现高效催化，将其替换为三氟甲基尿嘧啶。
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1.一种N-脱氧核糖转移酶的应用，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
5.一种催化体系，其特征在于：
6.根据权利要求5所述的催化体系，其特征在于：
7.根据权利要求5所述的催化体系，其特征在于：
8.根据权利要求5所述的催化体系，其特征在于：
9.一种催化生产曲氟尿苷中的方法，其特征在于：
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
【技术特征摘要】
1.一种n-脱氧核糖转移酶的应用，其特征在于：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
5.一种催化体系，其特征在于：
6.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯宏波，颜林江，钟芳敏，贾冰，陈琳，
申请(专利权)人：杭州中美华东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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