【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学，更具体地，涉及一种分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法。
技术介绍
1、核酸是抗肿瘤化疗药物的重要靶点。而临床使用的重要的化疗药物如柔红霉素等通过嵌入结合dna影响dna的复制和转录，导致dna损伤等机制来杀死肿瘤细胞。此外，共价结合dna的药物如顺铂等通过交联dna，导致肿瘤细胞的死亡。传统的靶向核酸化合物面临毒副作用和耐药性的多种问题。除了抗肿瘤药物开发以外，结合rna的小分子化合物成为第一个上市的治疗脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy简称：sma)的小分子化合物。这些也说明开发新型的核酸结合化合物在多种疾病的治疗中有潜在的意义。
2、天然产物一直是创新药物的重要源泉。据newman,d.j.,&cragg,g.m.等最新的统计，从1981年到2019年全球上市的小分子药物中超过60％都直接或间接和天然产物有关。尤其是在抗肿瘤药物中，70.8％的药物源于天然产物(journal of natural products2020,83,770-803)。嵌入结合dna的药物如阿霉素，柔红霉素，喜树碱、长春碱类、鬼臼毒素、小檗胺等均来源于天然产物。阿霉素和柔红霉素来源于波塞链霉菌代谢产物。喜树碱和长春碱和鬼臼毒素、小檗胺等来源于植物提取物。从天然提取物中筛选出新的嵌入结合核酸的化合物，可为开发新型的抗肿瘤药物以及其它以核酸为靶点的新药开发提供机会，为现有的药物结构改造提供独特思路，揭示dna结合化合物的构效关系，从而优化现有抗癌药物设计。
3、
4、目前分离纯化天然产物中化合物的主要方法为色谱法，包括吸附柱色谱法，分配色谱法，膜分离法和凝胶色谱法，离子交换色谱等。经过分离纯化后的组分再经过荧光、紫外、质谱等技术确定其中是否含有dna结合的化合物。但是这些方法都依赖于单一化合物的分离，如果存在分析干扰光谱或者质谱信号的化合物则无法分析。而分离纯化的过程需要大量的样品，繁琐的纯化步骤，一些不稳定的化合物可能在纯化过程中反应。因此，开发直接检测复杂的混合物如菌液，动植物提取物等，有助于快速鉴定产生核酸加合物的生物样本，对化合物的分离提供快速精准的指导，能加速新型的核酸结合化合物的发现。
5、单分子操纵技术已经广泛应用于小分子和核酸的相互作用的检测。perkins等在1995年用单个dna分子的拉伸实验观察到dna嵌入剂溴化乙啶嵌入dna引起双链dna长度增加(science,1995,268,83-87)。vladesc等人通过单分子操纵实验测量双链dna的力-拉伸曲线(force-extension curve)，用于定量dna嵌入剂和dna结合的解离常数(naturemethods,2007,4,517-522)。根据biebricher等人的报道(nature communications,2015，6(1),1-12)，每嵌入一个化合物分子会引起dna的轮廓长度增加0.34纳米。我们此前发展了一种用单分子力学操纵的方法检测小分子化合物和dna形成共价结合的嵌入型加合物的方法(cn15166131a)，该方法主要针对纯化后的单一化合物在酶催化下的共价结合核酸的能力进行定量，通过洗去非共价结合的化合物，检测共价结合的嵌入型加合物，并不针对非共价嵌入结合核酸的化合物，更无涉及复杂样品中是否存在非共价结合核酸的核酸嵌入剂的鉴定。
6、值得注意的是，此前的单分子分析主要用于已知的单一化合物与核酸嵌入结合能力的分析(nature methods,2007,4,517-522)。特别是针对简单溶液体系，即背景组分简单的溶液样品的分析和检测。比如化学合成的化合物，以及从天然产物中提取分离出来的单一化合物。目前，对于微生物、植物、动物的提取液，代谢产物，次生代谢物，待检测的自然界土壤样品，自然界水体样品等中是否存在非共价结合核酸的嵌入剂仍然缺乏有效的分析方法。针对复杂溶液系统中的微量核酸嵌入剂，能否在不经过纯化处理分离出单一核酸嵌入剂的情况下，用单分子方法检测仍是具有挑战性的课题。
技术实现思路
1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供一种分析复杂混合溶液中核酸嵌入剂的方法，首次将单分子操纵技术用于检测成分复杂的混合溶液(可来自于例如：微生物、植物、动物的提取液，代谢产物，次生代谢物；待检测的自然界土壤样品，自然界水体样品)，检测其中是否存在非共价嵌入双链核酸的小分子化合物，这一方法特别适用于天然有机化学领域，尤其可用于微生物核酸结合化合物的生物活性筛选，从微生物、动物和植物中发现新的核酸嵌入化合物。另外，该方法也可以用于药学领域，用于药物分析，即，用于非共价的核酸嵌入药物的药代动力学分析，药理学毒理学分析。
2、为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种使用单分子操纵检测分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、(a)准备待测的复杂混合溶液，所述待测的复杂混合溶液来自以下至少一种：微生物培养液，微生物提取液，微生物次生代谢物；动物体液，动植物组织，动植物组织提取液，动植物组织代谢产物；自然界土壤样品，自然界水体样品；
4、(b)将双链核酸分子固定在第一表面和第二表面之间，其中，所述第一表面保持位置不变，所述第二表面为可移动表面；
5、(c)通过力学拉伸双链核酸分子，测量双链核酸分子的长度；
6、(d)向双链核酸分子施加待测的复杂混合溶液，采用与步骤(c)力学拉伸相同的力学条件，通过力学拉伸双链核酸分子，检测双链核酸分子的长度变化，从而基于长度的变化，判断待测的复杂混合溶液中是否存在非共价嵌入结合核酸的化合物；
7、并且，所述方法还满足以下条件中的至少一者：
8、条件一：所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液自身不含酶成分，或者，所述待测的复杂混合溶液通过加热、超声、加入蛋白变性剂、加入酶抑制剂、加入金属离子螯合剂中的至少一种处理使体系中潜在的酶失活；
9、条件二：所述步骤(d)中，自所述施加待测的复杂混合溶液到开始检测双链核酸分子的长度变化，耗时小于10分钟。
10、作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液是通过将微生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种使用单分子操纵检测分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液是通过将微生物培养液、微生物提取液、微生物次生代谢物、动物体液、动植物组织提取液、动植物组织代谢产物中的至少一者离心取上清得到的；或者，是通过将动植物组织、土壤中的至少一者溶解分散于液体介质中后取上清得到的；
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液未经过纯化处理，是仅经过过滤和/或离心处理去除不可溶成分得到的澄清液体。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述双链核酸分子选自：双链DNA分子，双链RNA分子，DNA/RNA杂合链分子；
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述固定是将双链核酸的一条链至少一个碱基直接或间接的附着到第一表面，双链核酸另一条链的至少一个碱基直接或间接的附着到第二表面；
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述第一表面和第二表
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(c)中，所述力学拉伸所施加的外力在0.1皮牛顿～100皮牛顿范围内，由永磁体、电磁铁、离心机、声学、超声波、激光束、流体运动、流体浮力或重力施加；
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(c)和所述步骤(d)中，力学拉伸均是通过施加随时间变化的外力，并记录双链核酸分子随力学参数的长度变化过程。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，待测的复杂混合溶液中含有唯一一种非共价核酸嵌入剂、且该非共价核酸嵌入剂的种类已知时，所述方法还包括步骤：
10.如权利要求1－9任意一项所述方法在制备药物或筛选药物中的应用，判断复杂混合溶液是否含有非共价核酸嵌入化合物；
11.如权利要求1－9任意一项所述方法在制备药物或筛选药物时对药物药代动力学分析中的应用，其特征在于，待测的复杂混合溶液来自服药后动物的动物体液、动物组织、动物组织提取液和/或动物组织代谢产物。
12.如权利要求1－11任意一项所述方法在制备药物或筛选药物时对药物毒理学分析中的应用，其特征在于，待测的复杂混合溶液来自服药后动物的动物体液、动物组织、动物组织提取液和/或动物组织代谢产物。
13.如权利要求11或12所述应用，其特征在于，方法还包括步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种使用单分子操纵检测分析复杂混合溶液中非共价核酸嵌入剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液是通过将微生物培养液、微生物提取液、微生物次生代谢物、动物体液、动植物组织提取液、动植物组织代谢产物中的至少一者离心取上清得到的；或者，是通过将动植物组织、土壤中的至少一者溶解分散于液体介质中后取上清得到的；
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述待测的复杂混合溶液未经过纯化处理，是仅经过过滤和/或离心处理去除不可溶成分得到的澄清液体。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述双链核酸分子选自：双链dna分子，双链rna分子，dna/rna杂合链分子；
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述固定是将双链核酸的一条链至少一个碱基直接或间接的附着到第一表面，双链核酸另一条链的至少一个碱基直接或间接的附着到第二表面；
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(b)中，所述第一表面和第二表面独立的选自玻璃表面、塑料表面、石英表面、石墨烯表面、金属表面、陶瓷表面；
7.如权利要求1所述方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：游慧娟，蔡晓凤，刘天宇，蔡腾，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：
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