分枝杆菌的鉴定方法技术

技术编号：40553854 阅读：6 留言：0更新日期：2024-03-05 19:14

本发明专利技术涉及分枝杆菌的鉴定方法。该分枝杆菌的鉴定方法包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对待测样本进行分枝杆菌鉴定，引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.33‑SEQ ID No.277、如SEQ ID No.310‑SEQ ID No.554所示的引物。本申请通过使用多重PCR靶向捕获技术和高通量二代测序技术，提供了一种可以快速、准确、高效鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的引物组合及试剂盒，可以覆盖常见的9种结核分枝杆菌和49种非结核分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，特别是涉及分枝杆菌的鉴定方法。

技术介绍

1、分枝杆菌是放线菌的一个属，该属拥有超过190个被认可的物种，包括会导致哺乳动物严重疾病的病原体，例如结核分枝杆菌(mtb)、非结核分枝杆菌(ntm)、麻风分枝杆菌这几类。结核病是由结核分枝杆菌引起的一种疾病，现在仍然是国际上严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。根据世界卫生组织统计，世界人口的1/3有结核分枝杆菌感染，同时非结核分枝杆菌感染总体也呈上升趋势。结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌均可引起肺部以及其它部位病变，而且临床症状相似，鉴别诊断困难。在缺乏菌种鉴定的情况下，ntm肺病常被误诊为结核病。目前治疗ntm肺病尚无特效药物，不同菌种的治疗方案差别很大，且多数ntm对抗结核药物耐药，治疗效果不佳。常见的能够致病的mtb与ntm共计有几十种，且治疗药物的选择存在较大差异。因此在临床上，快速准确地判定患者是否存在mtb或ntm感染，是何种致病菌引起的感染，对制定有效的治疗方案具有重要意义。

2、目前，临床上鉴定mtb和ntm的传统方法主要为培养法，根据菌落形态、氧偏好性、烟酸积累、硝酸盐还原酶的活性等表型特征判断，方法简单、试剂价格便宜，易于推广而被沿用至今。但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性，不能准确区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，不能及时地为临床诊断提供参考。随着分子生物学技术的迅速发展，其他技术方法也开始应用于分枝杆菌的鉴定，例如荧光pcr技术、多色荧光熔解曲线技术、微流控芯片技术、核酸质谱技术、测序技术等，可以弥补传统方法的一些不足，

3、综上所述，目前的技术方案对分枝杆菌菌种鉴定，主要存在的问题包括检测周期长、检测覆盖范围有限、不能准确区分各类分枝杆菌等。

技术实现思路

1、基于此，本申请提供一种分枝杆菌的鉴定方法。采用该鉴定方法能够有效区别至少49种非结核分枝杆菌。

2、一种分枝杆菌的鉴定方法，包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定，所述引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如seq idno.33-seq id no.277、如seq idno.310-seq id no.554所示的引物。

3、上述鉴定方法中涉及的引物组合物能够有效区别至少49种非结核分枝杆菌，可以为临床诊断和用药提供更准确、更全面的参考。

4、在其中一个实施例中，所述非结核分枝杆菌包括：副胞内分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、不产色分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、新金色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、施氏分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、外来分枝杆菌、出众分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、伤口分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯卡纳分枝杆菌、免疫原分枝杆菌、伊朗分枝杆菌、败血症分枝杆菌、莲建洞分枝杆菌、拟鸟分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、博莱分枝杆菌、鸟分枝杆菌人猪共患亚种、鸟分枝杆菌森林土壤亚种中的至少一种。

5、在其中一个实施例中，所述引物组合物还包括结核分枝杆菌检测引物对，所述结核分枝杆菌检测引物对用于检测大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌中的至少一种。

6、在其中一个实施例中，所述结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如seq idno.1-seq id no.32、如seq id no.278-seq id no.309所示的引物。

7、在其中一个实施例中，所述引物组合物由碱基序列如seq id no.5-seq idno.9、seq id no.282-seq id no.286、seq id no.20-seq id no.22、seq idno.207-seq idno.299、seq id no.63-seq id no.67、seq id no.340-seq idno.344、seq id no.93-seqid no.97、seq id no.370-seq id no.374、seq idno.53-seq id no.57、seq id no.330-seq id no.本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种分枝杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定，所述引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，所述非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.33-SEQ IDNo.277、如SEQ ID No.310-SEQ ID No.554所示的引物。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述非结核分枝杆菌包括：副胞内分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、龟分枝杆菌、微黄分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌、不产色分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、新金色分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、母牛分枝杆菌、加那利群岛分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、施氏分枝杆菌、哥伦比亚分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、奥尔胡斯分枝杆菌、外来分枝杆菌、出众分枝杆菌、利雅得分枝杆菌、玛格丽特分枝杆菌、伤口分枝杆菌、产粘液分枝杆菌、罗讷河口分枝杆菌、蒂莫内分枝杆菌、托斯

3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物还包括结核分枝杆菌检测引物对，所述结核分枝杆菌检测引物对用于检测大羚羊分枝杆菌、结核分枝杆菌、条纹猫鼬分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、山羊分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、海豹分枝杆菌、非洲分枝杆菌中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.32、如SEQ ID No.278-SEQ IDNo.309所示的引物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物由碱基序列如SEQ ID No.5-SEQ ID No.9、SEQ ID No.282-SEQ ID No.286、SEQ ID No.20-SEQ IDNo.22、SEQ ID No.207-SEQ ID No.299、SEQ ID No.63-SEQ IDNo.67、SEQ ID No.340-SEQID No.344、SEQ ID No.93-SEQ ID No.97、SEQ IDNo.370-SEQ ID No.374、SEQ ID No.53-SEQ ID No.57、SEQ ID No.330-SEQ IDNo.334、SEQ ID No.68-SEQ ID No.72、SEQ IDNo.345-SEQ ID No.349、SEQ IDNo.69-SEQ ID No.71、SEQ ID No.346-SEQ ID No.348、SEQID No.78-SEQ IDNo.82、SEQ ID No.355-SEQ ID No.359、SEQ ID No.122-SEQ ID No.126、SEQ IDNo.399-SEQ ID No.403、SEQ ID No.112-SEQ ID No.116、SEQ ID No.389-SEQIDNo.393、SEQ ID No.137-SEQ ID No.141、SEQ ID No.414-SEQ ID No.418所示的引物构成。

6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述采用引物组合物对待测样本进行基因检测的步骤包括：采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增，然后进行测序，分析测序结果，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定。

7.根据权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应体系包括：ddH2O 1μL～5μL、Enhancer buffer NB(1N)3.5μL、Enhancer buffer M 2.5μL、Primer pool 5μL、DNA模板3μL～8μL、IGT-EM808polymerase mixture 10μL，总体积30μL。

8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于，采用所述引物组合物对所述待测样本进行多重PCR扩增的步骤中，反应条件包括：93℃～97℃保持3min～4min；97℃～99℃保持15s～20s、58℃～62℃保持5min～7min、18～22个循环；71℃～73℃保持4min～6min。

9.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物中，各引物的使用浓度为0.2μM～0...

【技术特征摘要】

1.一种分枝杆菌的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：采用引物组合物对待测样本进行基因检测，以对所述待测样本进行分枝杆菌鉴定，所述引物组合物包括非结核分枝杆菌检测引物对，所述非结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如seq id no.33-seq idno.277、如seq id no.310-seq id no.554所示的引物。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述结核分枝杆菌检测引物对包括碱基序列如seq id no.1-seq id no.32、如seq id no.278-seq idno.309所示的引物。

5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述引物组合物由碱基序列如seq id no.5-seq id no.9、seq id no.282-seq id no.286、seq id no.20-seq idno.22、seq id no.207-seq id no.299、seq id no.63-seq idno.67、seq id no.340-seqid no.344、seq id no.93-seq id no.97、seq idno.370-seq id no.374、seq id no.53-seq id no.57、seq id no.330-seq idno....

【专利技术属性】
技术研发人员：李尉，宋佳平，黄一婷，王亮，廖晓明，韦玉倩，
申请(专利权)人：珠海碳华检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

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