【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤类器官培养，具体地，本专利技术涉及一种用于培养结直肠癌类器官的新型培养基。
技术介绍
1、结直肠癌(crc)是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率已上升至世界恶性肿瘤的第三位，被广泛认为是一种细胞和分子水平的异质性疾病，其发病机制涉及多种基因改变和途径。好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60％。对于结直肠癌的研究与治疗往往都是以来源于病人的细胞系作为对象。但是细胞系在长期培养过程中，由于适应了二维生长的环境，从而丢失了体内原有生理特征和肿瘤的异质性。因此非常有必要建立一种全新的结直肠癌样本体外培养系统，为研究和治疗提供新途径。
2、因此，有需要开发一种适于结直肠癌类器官体外培养的培养基，以及简便、稳定、成功率高的结直肠癌类器官的体外培养方法。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
2、类器官是指将干细胞在体外3d培养，产生的“类似”器官样，具有自我更新和自我组织能力，结构和功能与来源组织或器官高度相似的微型器官，是目前唯一一个人源性组织水平的研究手段。拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织或器官的生理功能。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
3、虽然多种肿瘤组织使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养为类器官，但是目前关于结直肠癌类器官的培养方法的研究还需进一步探索。该体系能够提高结直肠
4、因此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种培养基。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括基础培养基、无菌水和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子和bmp拮抗剂的至少之一、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中加入上述特异性添加因子后，能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有高活性，能够稳定的传代冻存和复苏，并且同时适用于结直肠癌类器官的长期培养和类器官库扩建。
5、根据本专利技术的实施例，所述培养基进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
6、根据本专利技术的实施例，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中含有上述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的结直肠癌类器官模型，对结直肠癌类器官的生长有明显的促进作用。
7、根据本专利技术的实施例，所述特异性添加因子包括gremlin1、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中含有上述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的结直肠癌类器官模型，对结直肠癌类器官的生长有明显的促进作用，此外当培养基中添加所述gremlin1，能够维持细胞干性，类器官可以持续传代。
8、根据本专利技术的实施例，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、gremlin1、alk5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中同时添加所述胰岛素生长因子和gremlin1时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的结直肠癌类器官模型，对结直肠癌类器官的生长有明显的促进作用。
9、根据本专利技术的实施例，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
10、根据本专利技术的实施例，所述胰岛素生长因子为igf-1。专利技术人发现当培养基中添加所述胰岛素生长因子，能够促进类器官快速生长，促进细胞增殖。
11、根据本专利技术的实施例，所述alk 5抑制剂为a83-01。
12、根据本专利技术的实施例，所述rock抑制剂为y27632。
13、根据本专利技术的实施例，所述mapk抑制剂为sb202190。
14、根据本专利技术的实施例，所述基础培养基和无菌水的质量比为99:1。
15、需要说明的是，本申请所述的“胰岛素生长因子”为igf-1，是一种在分子结构上与胰岛素类似的多肽蛋白物质，是生长激素产生生理作用过程中必须的物质；本申请所述的“bmp拮抗剂”为gremlin 1重组蛋白，gremlin可能在癌变和后肾器官发生过程中发挥重要作用，作为早期肢体生长和维持fgf4-shh反馈回路模式所需的bmp拮抗剂；本申请中所涉及的“alk 5抑制因子”为a83-01(a83-01是一个强有力的tgf-βⅰ型受体alk-5(ic50：12nm)/alk4((ic50：45nm)/alk 7(ic50：7.5nm)激酶的抑制剂，a83-01对alk-5的抑制作用很强)；本申请中所涉及的“rock抑制剂”为y27632(rock为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，rock蛋白在肿瘤中的发生发展中起着重要作用)；本申请所述的“mapk抑制剂”为sb202190，其会与atp竞争抑制p38 map激酶活性。
16、根据本专利技术的实施例，所述基础培养基进一步包括氢离子缓冲剂，glutamax、青霉素和链霉素。因此，能够满足细胞生长的基本营养需求，进一步确保该培养基能够有利于结直肠癌类器官的培养，避免结直肠癌类器官被污染。
17、根据本专利技术的实施例，所述氢离子缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，即hepes。
18、根据本专利技术的实施例，所述氢离子缓冲剂在所述培养基中的终浓度为5～15mm。
19、根据本专利技术的实施例，所述glutamax在所述培养基中的终浓度为1～3mm。
20、根据本专利技术的实施例，所述青霉素在所述培养基中的终浓度450～550u/ml。
21、根据本专利技术的实施例，所述链霉素在所述培养基中的终浓度450～550u/ml。
22、根据本专利技术的实施例，所述alk 5抑制剂在所述培养基中的终浓度为450～550nm，所述rock1抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述mapk抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述r-spondinl在所述培养基中的终浓度为0.5-1.5μg/ml，所述b27在所述培养基中的终浓度为1×，所述gastrin1在所述培养基中的终浓度为5～15nm。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中的成分在此浓度范围内能够提高结直肠癌类器官构建的成功率并且保证类器官具有活性，能够稳定的传代、冻存、复苏，为后续科研人员对结直肠癌的治疗研究有极大的帮助作用。
23、需要说明的是“所述b27在所述培养基中的终浓度为1×”是指b27产品为50×的浓度，在配置培养基时，b27在培本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种培养基，其特征在于，包括基础培养基、无菌水和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子和Gremlin1、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括BMP拮抗剂、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondin、B27和Gastrin1。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、Gremlin1、ALK 5抑制剂、ROCK抑制剂、MAPK抑制剂、R-Spondinl、B27和Gastrin1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基
7.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述ALK 5抑制剂在所述培养基中的终浓度为450～550nM，所述ROCK1抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述MAPK抑制剂在所述培养基中的终浓度为5～15μm，所述R-Spondin,在所述培养基中的终浓度为0.5-1.5μg/ml，所述B27在所述培养基中的终浓度为1×，所述Gastrin1在所述培养基中的终浓度为5～15nM。
8.根据权利要求2或7所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素生长因子在所述培养基中的终浓度为20～70ng/ml。
9.根据权利要求3或7所述的培养基，其特征在于，所述Gremlin1在所述培养基中的终浓度为150～250ng/ml。
10.根据权利要求4或7所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素生长因子在所述培养基中的终浓度为20～70ng/ml，所述Gremlin1在所述培养基中的终浓度为150～250ng/ml。
11.权利要求1～10任意一项所述培养基在培养结直肠癌类器官中的用途。
12.一种制备结直肠癌器官的方法，其特征在于，包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述结直肠癌细胞分离自结直肠癌组织。
...【技术特征摘要】
1.一种培养基，其特征在于，包括基础培养基、无菌水和特异性添加因子，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子和gremlin1、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括bmp拮抗剂、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondin、b27和gastrin1。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括胰岛素生长因子、gremlin1、alk 5抑制剂、rock抑制剂、mapk抑制剂、r-spondinl、b27和gastrin1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为dmem/f12培养基；
6.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基进一步包括氢离子缓冲剂、glutamax、青霉素和链霉素；
7.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志东，孟盛雯，罗克，
申请(专利权)人：伯桢生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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