【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养领域，具体地，本专利技术涉及一种真实模拟人类宫颈癌组织特征的类器官模型的构建方法。
技术介绍
1、宫颈癌是世界范围内最严重的妇科癌症之一，根据目前的数据，它在全世界所有癌症中排名第14位，是世界上第四常见的妇科恶性肿瘤类型，其死亡率高，特别是在发展中国家，大约90％的宫颈癌发生在低收入和中等收入国家，这些国家缺乏有组织的筛查和hpv疫苗接种规划。目前，宫颈癌干预侧重于一级和二级预防，一级预防和筛查是降低宫颈癌负担和死亡率的最佳方法。尽管在病毒侵入前宫颈病变的筛查、检测和治疗方面取得了重大进展，但在世界范围内宫颈癌发病率、治疗和死亡率存在很大差异，国际妇科癌症协会开发临床相关和循证指南，以提高世界各地宫颈癌妇女的护理质量。2018年，全球共诊断出569847例宫颈癌新病例，这种恶性肿瘤导致311365人死亡，相关性死亡率高达54.6％，我国发病人数占全球的18.6％。
2、目前研究宫颈癌的体外模型以原代细胞系扩增的2d细胞居多，尚没有支持研究hpv持续感染引起的宫颈癌体外模型。因此，亟需研究宫颈癌类器官以为宫颈癌的发生、发展、治疗提供研究模型。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
2、类器官可以概括其器官特异性基因表达特征、特定的组织空间结构和原始组织的功能。在药物敏感性筛查方面，类器官相较于常规2d细胞及目前最常用的患者异种移植瘤(pdx)有着巨大优势，2d细胞比较单一且无法再现肿瘤组
3、因此，专利技术人建立了一种患者来源的可以准确再现宫颈癌组织结构和功能的原代、非转化的培养物体系，即宫颈癌类器官，可以在体外培养过程中用于阐释宫颈癌病变的分子机制，用于建立病毒感染模型，研究肿瘤耐药性及耐辐射性，在体外代替患者测试药物敏感性，为促进宫颈癌治疗、评估个性化药物敏感性提供有力的模型。因此，研究宫颈癌类器官可以为宫颈癌的发生、发展、治疗提供研究模型。
4、因此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种培养基。根据本专利技术的实施例，所述培养基包括基础培养基以及添加物，所述添加物包括神经营养因子和生长因子的至少之一以及烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中加入上述添加物后能够快速有效的建立起可在体外长期培养的宫颈癌类器官模型，并且同时适用于宫颈癌类器官的长期培养和类器官库扩建，为促进宫颈癌治疗、评估个性化药物敏感性提供有力的模型。
5、根据本专利技术的实施例，所述培养基还可以进一步包括如下附加特征的至少之一：
6、根据本专利技术的实施例，所述添加物包括神经营养因子、烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的宫颈癌类器官模型，对宫颈癌类器官的生长有明显的促进作用。
7、根据本专利技术的实施例，所述添加物包括生长因子、烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的宫颈癌类器官模型，对宫颈癌类器官的生长有明显的促进作用。
8、根据本专利技术的实施例，所述添加物包括神经营养因子、生长因子、烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。专利技术人经过不断试验发现，当培养基中含有所述的添加物时，能够快速有效的建立起可在体外长期培养的宫颈癌类器官模型，对宫颈癌类器官的生长有明显的促进作用。
9、根据本专利技术的实施例，所述神经营养因子为manf。
10、根据本专利技术的实施例，所述生长因子为hdgf。
11、根据本专利技术的实施例，所述基础培养基为dmem/f12培养基。
12、根据本专利技术的实施例，所述rock抗凋亡因子为y27632。
13、根据本专利技术的实施例，所述alk-5抑制因子为a83-01。
14、根据本专利技术的实施例，所述p38 mapk抑制剂为sb202190。
15、需要说明的是，本申请所述的“神经营养因子”为manf(中脑星形胶质细胞来源神经营养因子)，具有独特的三维结构，包含n端saposin样结构域和c端sap(saf-a/b,acinusand pias,sap)结构域，决定其特殊的作用形式；本申请所述的“生长因子”为hdgf(肝癌源性生长因子)，是一种肝素结合的生长因子，在血管增生、内皮细胞增殖、迁移等细胞活动中发挥着重要作用；本申请中所涉及的“alk-5抑制因子”为a83-01(a83-01是一个强有力的tgf-βⅰ型受体alk-5(ic50：12nm)/alk4((ic50：45nm)/alk 7(ic50：7.5nm)激酶的抑制剂，a83-01对alk-5的抑制作用很强)；本申请所述的“noggin蛋白”是bmp信号通路的抑制因子；本申请中所涉及的“rock抗凋亡因子”为y27632(rock为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，rock蛋白在肿瘤中的发生发展中起着重要作用)；本申请所述的“n2”为一种不含血清的添加剂，用于成神经细胞瘤以及周围神经系统(pns)与中枢神经系统(cns)的原代细胞培养中有丝分裂后期神经元的生长和表达；本申请所述的“b27”是一种无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(cns)神经元的生长和保持其短期或长期活性；本申请所述的“p38 mapk抑制剂”为sb202190，其会与atp竞争抑制p38 map激酶活性；本申请所述的“noggin蛋白”是bmp信号通路的抑制因子。
16、根据本专利技术的实施例，所述基础培养基进一步包括氢离子缓冲剂，glutamaxtm和青链霉素双抗。
17、根据本专利技术的实施例，所述氢离子缓冲剂为4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
18、根据本专利技术的实施例，所述氢离子缓冲剂在所述培养基中的浓度为5～15mm。
19、根据本专利技术的具体实施例，所述氢离子缓冲剂在所述培养基中的浓度为10mm。
20、根据本专利技术的实施例，所述glutamaxtm在所述培养基中的浓度为1～10mm。
21、根据本专利技术的实施例，所述glutamaxtm在所述培养基中的浓度为5mm。
22、根据本专利技术的实施例，所述青链霉素双抗在所述培养基中的浓度为20～70u/ml。
23、根据本专利技术的实施例，所述青链霉素双抗在所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种培养基，其特征在于，包括基础培养基以及添加物，所述添加物包括神经营养因子和生长因子的至少之一以及烟酰胺、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、ALK-5抑制因子、ROCK抗凋亡因子、p38 MAPK抑制剂和人Noggin蛋白。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物包括神经营养因子、烟酰胺、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、ALK-5抑制因子、ROCK抗凋亡因子、p38 MAPK抑制剂和人Noggin蛋白。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物包括生长因子、烟酰胺、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、ALK-5抑制因子、ROCK抗凋亡因子、p38 MAPK抑制剂和人Noggin蛋白。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物包括神经营养因子、生长因子、烟酰胺、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、ALK-5抑制因子、ROCK抗凋亡因子、p38 MAPK抑制剂和人Noggin蛋白。
5.根据权利要求1～4任一项所述的培养基，其特征在于，所述神经营养因子为MANF；
6.根据权利要求5所
7.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述烟酰胺在所述培养基中的浓度为5～15mM，所述N2在所述培养基中的浓度为5～15nM，所述B27在所述培养基中的体积分数为1～3％，所述N-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的浓度为0.5～2mM，所述ALK-5抑制因子在所述培养基中的浓度为1～3μM，所述ROCK抗凋亡因子在所述培养基中的浓度为5～15μM，所述p38 MAPK抑制剂在所述培养基中的浓度为0.5～2μM，所述人Noggin蛋白在所述培养基中的浓度为90～110ng/ml。
8.根据权利要求2或7所述的培养基，其特征在于，所述神经营养因子在所述培养基中的浓度为40～60ng/ml。
9.根据权利要求3或7所述的培养基，其特征在于，所述生长因子在所述培养基中的浓度为40～60ng/ml。
10.根据权利要求4或7所述的培养基，其特征在于，所述神经营养因子在所述培养基中的浓度为40～60ng/ml，所述生长因子在所述培养基中的浓度为40～60ng/ml。
11.权利要求1～10任意一项所述培养基在培养宫颈癌类器官中的用途。
12.一种制备宫颈癌类器官的方法，其特征在于，包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述宫颈癌细胞分离自宫颈癌组织。
...【技术特征摘要】
1.一种培养基，其特征在于，包括基础培养基以及添加物，所述添加物包括神经营养因子和生长因子的至少之一以及烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物包括神经营养因子、烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物包括生长因子、烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加物包括神经营养因子、生长因子、烟酰胺、n2、b27、n-乙酰半胱氨酸、alk-5抑制因子、rock抗凋亡因子、p38 mapk抑制剂和人noggin蛋白。
5.根据权利要求1～4任一项所述的培养基，其特征在于，所述神经营养因子为manf；
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基进一步包括氢离子缓冲剂，glutamaxtm和青链霉素双抗；
7.根据权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王栋，董亚腾，罗克，
申请(专利权)人：伯桢生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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