【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞体外杀伤实验研究，尤其涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞的评测方法。
技术介绍
1、细胞免疫疗法是一种利用免疫系统细胞消除癌症的治疗形式。目前，总的来说，大概包括嵌合抗原受体(car)t细胞治疗、自然杀伤细胞(nk)疗法、工程化t细胞受体(tcr)治疗和肿瘤浸润淋巴细胞(til)治疗等。其中一些方法涉及对肿瘤患者免疫细胞进行基因工程改造以增强患者自身免疫细胞的抗癌能力，而另一些方法涉及直接分离肿瘤患者自己的免疫细胞并在体外扩大其数量后用于回输治疗。til治疗是从实体瘤组织中获取浸润的淋巴细胞，体外培养和扩增，然后回输治疗患者。其多样的tcr克隆性、优越的肿瘤归巢能力和较低的靶向毒性使til疗法在治疗实体瘤方面具有其他过继性细胞疗法所不具备的独特优势。而这些自实体瘤组织中分离出来的肿瘤浸润淋巴细胞(til)对肿瘤细胞的杀伤能力大小可以直接用于预测til治疗效果。因此，如何在体外直观评价til杀伤肿瘤细胞的有效性作为后续回输治疗的基础显得尤为重要。目前，较为常用的肿瘤细胞体外杀伤评价方法主要是间接法(参考一些杀伤相关指标的变化，即通过参数和数据反馈得到的间接评价方法)；但是，还缺少一种简易且快速、可直观地观察til体外杀伤肿瘤细胞情况的方法。
技术实现思路
1、(一)要解决的技术问题
2、鉴于上述技术问题，本专利技术提供一种肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞的评测方法，该方法可快速、直观、简易且准确地观测和统计肿瘤浸润淋巴细胞在体外杀伤肿瘤细胞的情况，
3、(二)技术方案
4、为了达到上述目的，一方面，本专利技术提供一种肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞的评测方法，其包括：
5、s1、采用cmfda标记肿瘤细胞，并在培养基中培养；
6、s2、将待测肿瘤浸润淋巴细胞与所述cmfda标记肿瘤细胞转入共培养基中进行共培养；
7、s3、荧光显微镜观测，或者进一步采用酶标仪检测残留贴壁肿瘤细胞的荧光信号。
8、根据本专利技术的较佳实施例，s1中，所述培养基的成分为：在dmed培养基中添加0.8-1.2wt％青霉素/链霉素和8-12wt％胎牛血清。
9、根据本专利技术的较佳实施例，s2中，所述共培养基的成分为：在x-vivo-15培养基中添加有0.8-1.2wt％青霉素/链霉素、8-12wt％胎牛血清、25-35ng/ml cd3抗体和800-1200iu/ml il-2。
10、根据本专利技术的较佳实施例，s1包括如下步骤：
11、s11、用胰酶消化贴壁的肿瘤细胞，收集待检测的肿瘤细胞，用无菌pbs洗涤，离心去除上清，使用无菌pbs重悬并使用计数仪计数；
12、s12、将cmfda干粉取出回温至室温，后用dmso溶解cmfda，充分混匀；用无血清培养基稀释得到cmfda浓度为0.5-2.5μm的标记工作液；
13、s13、离心收集s11中待检测的肿瘤细胞，并吸除上清，用s12中cmfda标记工作液轻柔地重悬肿瘤细胞实现染色标记；
14、s14、将cmfda标记的肿瘤细胞铺到培养板中，放入37±0.2℃二氧化碳培养箱中静置培养3h以上，尽量避免培养板被振动，待肿瘤细胞贴壁舒展。
15、根据本专利技术的较佳实施例，s2包括如下步骤：
16、s21、吸弃已贴壁的肿瘤细胞的上清，将收集的肿瘤浸润淋巴细胞按照1:5至40:1的效靶比加入到铺有贴壁肿瘤细胞的培养板中，加入共培养基进行共培养；
17、s22、将培养板置于37±0.2℃二氧化碳培养箱中静置培养，尽量避免培养板被振动影响细胞贴壁，培养36h以上。
18、根据本专利技术的较佳实施例，s3包括如下步骤：s31、使用荧光显微镜拍照观察肿瘤细胞的形态和周围清液中裂解的荧光碎片；
19、s32、荧光成像结果拍照结束后，弃上清，并用1xpbs洗涤2次以上，弃pbs后，直接将培养板放入酶标仪中，在ex＝492nm/em＝517nm的条件下，检测贴壁细胞的荧光强度；根据检测的荧光强度值，计算肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力评测值。
20、另一方面，本专利技术还提供一种用于直观观测til细胞体外杀伤肿瘤细胞的细胞模型，所述细胞模型为cmfda标记的肿瘤细胞。
21、其中，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞、结直肠癌细胞、宫颈癌细胞、乳腺癌细胞或鼻咽癌细胞等各种肿瘤细胞。
22、第三方面，一种用于直观观测til细胞体外杀伤肿瘤细胞并评价til细胞杀伤能力的细胞模型的制备方法，其包括：
23、步骤1、用胰酶消化贴壁的肿瘤细胞，收集待检测的肿瘤细胞，用无菌pbs洗涤，离心去除上清，使用无菌pbs重悬并使用计数仪计数；
24、步骤2、将cmfda干粉取出回温至室温，后用dmso溶解cmfda，充分混匀；用无血清培养基稀释得到cmfda浓度为0.5-2.5μm的标记工作液；
25、步骤3、离心收集步骤1中待检测的肿瘤细胞，并吸除上清，用步骤2中cmfda标记工作液轻柔地重悬肿瘤细胞实现染色标记；
26、步骤4、将cmfda标记的肿瘤细胞铺到培养板中，放入37±0.2℃二氧化碳培养箱中静置培养3h以上，尽量避免培养板被振动，待肿瘤细胞贴壁舒展。
27、在使用上述细胞模型进行肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的评测时，其方法如下：
28、吸弃已贴壁的肿瘤细胞的上清，将收集的肿瘤浸润淋巴细胞按照1:5至40:1的效靶比加入到铺有贴壁肿瘤细胞的培养板中，加入共培养基进行共培养；
29、将培养板置于37±0.2℃二氧化碳培养箱中静置培养，尽量避免培养板被振动影响细胞贴壁，培养36h以上；
30、使用荧光显微镜拍照观察肿瘤细胞的形态和上清中裂解的荧光碎片，得到用于直观观测til细胞体外直接杀伤肿瘤细胞的模型；
31、荧光成像结果拍照结束后，弃上清，并用1xpbs轻柔地(尽量避免贴壁细胞被洗掉)洗涤2次以上，弃洗涤pbs后，将培养板放入酶标仪中，在ex＝492nm/em＝517nm的条件下，检测贴壁细胞的荧光强度，根据荧光强度值定量计算待测til细胞体外杀伤肿瘤细胞评测值。
32、(三)有益效果
33、(1)本专利技术基于cmfda染料的特性，采用cmfda标记肿瘤细胞,再将til细胞在体外与cmfda标记的肿瘤细胞共培养一段时间,采用荧光显微镜观测游离的荧光信号,可直观地观测到肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤情况,能够对til细胞体外杀伤肿瘤细胞的能力进行评测，也能用于评估细胞免疫治疗产品的治疗效果。
34、(2)本专利技术构建的评测方法快速、直观、简易，可操作性强，适用于体外评估免疫细胞杀伤肿瘤细胞的有效性、深入研究免疫细胞杀伤肿瘤细胞的原理以及本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞的评测方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的评测方法，其特征在于，S2中，所述共培养基的成分为：在X-VIVO-15培养基中添加有0.8-1.2wt％青霉素/链霉素、8-12wt％胎牛血清、25-35ng/mL CD3抗体和800-1200IU/mLIL-2。
3.根据权利要求1所述的评测方法，其特征在于，S1中，所述培养基的成分为：在DMED培养基中添加0.8-1.2wt％青霉素/链霉素和8-12wt％胎牛血清。
4.根据权利要求1或3所述的评测方法，其特征在于，S1包括如下步骤：
5.根据权利要求1或2所述的评测方法，其特征在于，S2包括如下步骤：
6.根据权利要求1或2所述的评测方法，其特征在于，S3包括如下步骤：
7.一种用于评测TIL细胞体外杀伤肿瘤细胞能力的细胞模型，其特征在于，所述细胞模型为CMFDA标记的肿瘤细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞模型，其特征在于，所述肿瘤细胞为肺癌细胞、肝癌细胞、胃癌细胞、食道癌细胞、结直肠癌细胞
9.一种用于直观观测TIL细胞体外杀伤肿瘤细胞并评价TIL细胞杀伤能力的细胞模型的制备方法，其特征在于，包括：
10.权利要求9所述制备方法制备的细胞模型的使用方法，其特征在于，步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种肿瘤浸润淋巴细胞体外杀伤肿瘤细胞的评测方法，其特征在于，其包括：
2.根据权利要求1所述的评测方法，其特征在于，s2中，所述共培养基的成分为：在x-vivo-15培养基中添加有0.8-1.2wt％青霉素/链霉素、8-12wt％胎牛血清、25-35ng/ml cd3抗体和800-1200iu/mlil-2。
3.根据权利要求1所述的评测方法，其特征在于，s1中，所述培养基的成分为：在dmed培养基中添加0.8-1.2wt％青霉素/链霉素和8-12wt％胎牛血清。
4.根据权利要求1或3所述的评测方法，其特征在于，s1包括如下步骤：
5.根据权利要求1或2所述的评测...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘海洋，韩英，宋瑾，赵倩，于金璇，倪辰星，沈宁，张恒辉，
申请(专利权)人：北京臻知医学科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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