【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域、生物医药领域，具体涉及一种基于工程细胞系检测抗原肽段亲和力的方法。
技术介绍
1、hla(human leucocyte antigen)复合体是人类多态性最丰富的遗传系统，定位于第6号染色体短臂6p21.31区，长3600kb。1999年已完成全部序列分析及基因定位，在此区域内共确认了224个基因座位中128个为功能性基因，其中39.8％和免疫功能相关。hla基因根据其编码分子的分布与功能不同分为3个区，即ⅰ类基因区，ⅱ类基因区，ⅲ类基因区。经典的hlaⅰ类抗原包括hla-a、hla-b、hla-c；hlaⅱ类抗原包括hla-dp、hla-dq、hla-dr。非经典的hlaⅰ、ⅱ类有hla-f、e、h、x、dn、do、dm等。hlaⅰ类几乎分布于身体全部细胞表面，ⅱ类主要是定位于巨噬细胞和b淋巴细胞表面的糖蛋白。
2、hla等位基因频率不仅在不同人群、不同地域存在明显差异，而且与某些疾病的发生存在一定的相关性。hla分型不仅为了解人种来源和民族的迁徙提供重要的科学资料，而且在医学实践中有重要意义。
3、中国人群中常见的hla-a基因有hla-a*02：01、hla-a*11:01，hla-a*24：02，其中，hla-a*11:01是中国人群最为常见的hla-i类分子的型别。但是，对于多种多样的hla型别缺乏验证其相应抗原肽的亲和力的工具细胞系。下一代测序技术和生物信息学分析能力的发展使得大量新生抗原肽被发现，如何验证这些抗原肽与hla分子的亲和力及其免疫原性面临着巨大的挑战
技术实现思路
1、为了丰富了对不同hla型别的抗原肽免疫原性的验证方法，本专利技术构建了一种工程细胞系，基于该工程细胞系可以有效检测抗原肽段亲和力。具体地，本专利技术提供了以下技术方案：
2、第一方面，本专利技术提供了一种灵敏检测目标肽免疫原性的方法，所述方法包括将目标肽与工程细胞相接触，所述工程细胞具有以下特征：
3、1)野生型工程细胞的表面缺乏hla，
4、2)在工程细胞中过表达的hla分子，所述hla的型别与目标肽对应，
5、3)工程细胞中的tap基因被敲除或tap的表达被抑制。
6、优选地，所述方法中还包括免疫原性检测的步骤，所述免疫原性检测的方法包括但不限于流式细胞技术、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorb ent assay，elisa)、放射免疫分析法(ria)、荧光免疫、化学发光免疫测定、电化学发光(electrochemiluminescence immunoassay，ecli)检测、表面等离子体共振检测法(spr)、全自动纳升级免疫分析工作站gyrolab、酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospotassay，elispot)、生物测定法等，所述eli sa包括四种主要类型：直接法、间接法、竞争法和双抗夹心法。
7、优选地，本专利技术所述hla的型别包括任意型别，在此引入hla数据库https://hla.alleles.org/nomenclature/index.html中所有型别；示例性的，hla i类包括hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g，其中，hla-a中又包括a*01:01、a*01:02、a*01:03、a*01:06、a*01:07、a*01:08、a*01:09、a*01:10、a*01:12、a*01:13等，hla-b中又包括b*07:02、b*07:03、b*07:04、b*07:05、b*07:06、b*07:07、b*07:08、b*07:09、b*07:10、b*07:11等；hlaii类包括hla-dra、hla-drb1、hla-drb2-9、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1、hla-dpb1，各类中还包括多种分型。
8、优选地，本专利技术具体实施例中以a0201(a*02:01)、a1101(a*11:01)、a2402(a*24:02)、b4001(b*40:01)、b4601(b*46:01)、c0102(c*01:02)、c0702(c*07:02)进行了示例性的验证。
9、优选地，所述目标肽所对应的hla型别是本领域技术人员根据常规技术可以确认的。所述目标肽包括具有任意序列的肽。
10、本专利技术所述术语“目标肽”、“多肽”、“多肽片段”和“蛋白质”在此可以互换使用，指的是氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是人工合成的非天然存在的氨基酸(如相应的天然存在氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物。
11、本专利技术所述tap也即抗原处理相关转运体(antigen transfer associatedprocess protein)是由tap1和tap2两个亚基形成的异二聚体跨膜转运蛋白。
12、优选地，所述tap基因被敲除是tap1和/或tap2被敲除，优选，tap1和tap2同时被敲除。
13、优选地，所述敲除的方法包括crispr技术、rna干扰技术、反义寡核苷酸(aso)技术、talen技术、zfn技术、cre-loxp基因重组技术等基因编辑技术所使用的试剂。
14、优选地，所述敲除的方法是crispr技术。
15、优选地，所述过表达是通过病毒载体转染实现的。
16、本专利技术所述原始细胞还可以是任意来源、任意类型的细胞，优选人类细胞，优选非免疫细胞，所述人类细胞例如：造血细胞、神经细胞、血液细胞、脂肪细胞、间充质细胞、肌肉细胞、心脏细胞、肝脏细胞、胰腺细胞、皮肤细胞等。所述人类细胞还可以是细胞系，例如：cho细胞、293细胞、cho-k1细胞、hek293细胞、caco2细胞、u2-os细胞、nih 3t3细胞、nso细胞、sp2细胞、cho-s细胞、dg44细胞、k-562细胞、u-937细胞、mrc5细胞、imr90细胞、jurkat细胞、hepg2细胞、hela细胞、ht-1080细胞、hct-116细胞、hu-h7细胞、huvec细胞、molt 4细胞等。
17、优选地，所述原始细胞是k562细胞。
18、具体地，所述野生型工程细胞也即未经任何人工处理的原始细胞，所述原始细胞表面缺乏的hla分子包括hla i类和/或hla ii类。在本专利技术具体实施例中以k562作为原始细胞为例。
19、另一方面，本专利技术提供了以上工程细胞的制备方法，所述方法包括过表达hla和敲除(包括抑制)tap基因的步骤。
20、在一种具体的实施方式中，前述一种灵敏检测目标肽免疫原性的方法通过该制备方法得到的工程细胞进行。
21、本专利技术所述过表达即提高所述hla的瞬时表达量或稳定表达量。在一种实施例中，编码所述重组蛋白的核酸可以染色体性地整合入细胞的基因组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种灵敏检测目标肽免疫原性的方法，所述方法包括将目标肽与工程细胞相接触，所述工程细胞具有以下特征：
2.如权利要求1所述方法，所述原始细胞表面缺乏HLA I类和/或HLA II类；
3.如权利要求1所述方法，所述TAP基因被敲除是TAP1和/或TAP2被敲除，优选，TAP1和TAP2同时被敲除；
4.一种工程细胞的制备方法，所述方法包括过表达HLA和敲除TAP基因的步骤；
5.如权利要求4所述制备方法，所述过表达包括提高所述HLA的瞬时表达量或稳定表达量；
6.如权利要求4所述制备方法，所述敲除TAP基因的方法包括CRISPR技术、RNA干扰技术、反义寡核苷酸技术、TALEN技术、ZFN技术、Cre-loxP基因重组技术等基因编辑技术所使用的试剂；
7.如权利要求4所述制备方法，所述敲除TAP是敲除TAP1和/或TAP2，优选，同时敲除TAP1和TAP2；
8.如权利要求4所述制备方法，所述Cas蛋白包括SpCas9、SaCas9及其突变体。
9.权利要求4所述制备方法所制备得到的
10.权利要求9所述工程细胞在检测目标肽免疫原性的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种灵敏检测目标肽免疫原性的方法，所述方法包括将目标肽与工程细胞相接触，所述工程细胞具有以下特征：
2.如权利要求1所述方法，所述原始细胞表面缺乏hla i类和/或hla ii类；
3.如权利要求1所述方法，所述tap基因被敲除是tap1和/或tap2被敲除，优选，tap1和tap2同时被敲除；
4.一种工程细胞的制备方法，所述方法包括过表达hla和敲除tap基因的步骤；
5.如权利要求4所述制备方法，所述过表达包括提高所述hla的瞬时表达量或稳定表达量；
6.如权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：张恒辉，梁皓，沈宁，张权，张晓娜，魏玲，侯亚璐，韩英，
申请(专利权)人：北京臻知医学科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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