一种检测结核分枝杆菌耐药基因的引物组合物及其应用制造技术

本申请公开了一种引物组合物及其应用。采用本申请的引物组合物能够用于检测15种治疗结核分枝杆菌感染的药物的45个耐药基因的全长序列，不仅能够检测目前已知的突变，还可以用于检测未知突变，检测覆盖度更广。检测覆盖度更广。检测覆盖度更广。

【技术实现步骤摘要】
一种检测结核分枝杆菌耐药基因的引物组合物及其应用


[0001]本申请属于基因检测
，具体涉及一种检测结核分枝杆菌耐药基因的引物组合物及其应用。

技术介绍

[0002]结核病由结核分枝杆菌(MTB)引起，死亡率位居感染疾病的第二位。据WHO估算，全球结核潜伏感染人群接近20亿，大约5
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10％的结核分枝杆菌感染者将在其一生中发展为活动性结核病。肺部感染占活动性结核病的75％，是导致结核病高死亡率的主要因素。确定结核分枝杆菌感染者并尽早对发生结核分枝杆菌的患者进行适当治疗，无疑是有效控制结核病的关键。然而结核分枝杆菌的多重耐药性是现代结核病治疗过程中面临的最大困难和严峻挑战。近10年来，结核分枝杆菌对包括异烟肼、利福平和乙胺丁醇等临床主流的抗结核杆菌药物耐药性已明显上升，导致病情拖延。选择有效药物，加快结核病药物耐药性的诊断是目前急需解决的问题。
[0003]自上世纪90年代发现异烟肼耐药基因katG以来，人们已经找到包括利福平耐药基因rpoB在内的40余个结核分枝杆菌抗结核药物的耐药基因，也创建了基于实时荧光定量PCR技术、等温(恒温)扩增技术、熔解曲线技术、核酸质谱技术、液相芯片技术、基因测序技术等各种结核分枝杆菌耐药基因检测方法。相关案例如下：
[0004]专利CN201410815076.X公开了一种基于多重实时荧光PCR的检测结核分枝杆菌耐药基因的方法。该方法包含一组可以检测样品中结核分枝杆菌耐药基因突变的探针，以样品基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，得到扩增曲线，通过含有某种荧光报告基团的扩增曲线及Ct值，判断该基因是否存在点突变，在较短的时间内检测待测样品中结核分枝杆菌的7个耐药基因的突变情况，结果灵敏度高、特异性较好，分析过程简便。不足之处是，检测范围有限，只能针对少数且已知的耐药基因和突变位点进行检测。同时，该方法对引物要求较高，可能出现非特异性扩增的情况，影响检测准确性。
[0005]专利CN201911415507.2公开了一种基于新一代测序的结核杆菌耐药基因检测方法。该方法包含一系列针对结核杆菌耐药性基因的测序引物，检测步骤主要包括样本前处理、DNA提取、目标位点PCR扩增、文库构建、DNA测序，能同时对常见抗结核药物17种耐药基因的48个位点进行突变检测，可以更好地指导结核病用药。不足之处是，检测覆盖度有限，只针对部分已知的耐药基因和突变位点进行检测，而目前已报道的耐药基因有40种以上、耐药突变位点有上千个，未覆盖的区域会存在漏检的情况。
[0006]专利CN202110176138.7公开了一种基于荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药突变的方法及试剂盒，能够在体外快速定性检测结核病患者的结核分枝杆菌复合群阳性的痰液培养物样本中利福平耐药基因rpoB和异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC耐药决定区耐药突变。不足之处是，检测覆盖度有限，只能针对少数且已知的耐药基因和突变位点进行检测。同时该技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
[0007]专利CN202110752683.6公开了一种基于Luminex液相芯片的检测结核分枝杆菌及耐药基因突变位点的方法。该方法包含一系列检测引物和探针，能够检测样本中是否存在结核分枝杆菌，并覆盖异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、链霉素等药物的耐药突变位点，检测速度快，完成一次检测仅需3.5小时，一次可以同时检测多达96个样本。不足之处是，受微球种类的限制，可检测的突变位点的数量有限，且只能检测已知基因突变位点，不能检测未知突变。Luminex液相芯片技术能够实现同时对多个位点的检测，但它仅在检测方面发挥了其多通量、高效率的特性，其实质上并没有解决多重扩增中众多引物、探针、模板间相互错配的问题。另外，由于需要将引物束缚至固相载体，这在一定程度上限制了引物与模板的碰撞概率并且导致其扩增效率降低。
[0008]专利CN202210006972.6公开了一种基于核酸质谱的结核分枝杆菌耐药基因的检测方法，该方法结合单碱基延伸反应技术，通过确定katG315、rpoB435和embB306基因的待测突变位点，设计出扩增引物和各突变位点的延伸引物，经过PCR扩增、消化处理、延伸反应后使用树脂纯化，纳升点样制备样本并上质谱检测，最终经过比对确定位点突变信息，从而判定结核分枝杆菌的对异烟肼、利福平和乙胺丁醇的耐药性。检测结果可广泛应用于临床检验、疾病预防等领域。不足之处是，不能检测未知突变，每次检测样本和位点数有一定要求。另外，可能存在离子抑制效应，如果物质不纯、有杂质存在，会降低质谱的灵敏度。
[0009]综上所述，目前的技术方案针对结核病耐药基因检测，或检测范围小，不能大范围覆盖耐药基因及突变位点，导致耐药位点无法准确检出；或者虽然有较大覆盖范围，但只能针对已知基因和特定目标突变(通常是已知位点)进行检测。

技术实现思路

[0010]本申请针对15种抗结核杆菌的药物、收集了常见的45个耐药基因，在NCBI数据库中获取相关基因在基因组上的位置信息，以及获得基因全长信息，通过使用多重PCR靶向捕获技术和高通量二代测序技术，设计了本申请的引物组合物和检测方法，对全部的45个耐药基因可以进行全长序列的检测，从而能检测这些基因中任意位点的突变，即不仅可以覆盖结核分枝杆菌常见的45个耐药基因，可检测上千个已知的耐药相关突变位点，还能检测耐药基因上的新突变，可以更准确、更全面地指导临床结核病用药。
[0011]本申请第一方面提供了一种引物组合物，其包含第一引物组合和第二引物组合，其中，所述第一引物组合包含：SEQ ID NO.1～392所示的引物，所述第二引物组合包含SEQ ID NO.393
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784所示的引物。
[0012]本申请第二方面提供了一种结核分枝杆菌药物耐受基因检测试剂盒，其包括本申请第一方面所提供的引物组合物。
[0013]本申请第三方面提供了本申请第一方面所提供的引物组合物或本申请第二方面所提供的试剂盒用于检测结核分枝杆菌药物耐受基因和/或其任意突变的用途。
[0014]本申请第四方面提供了一种检测样品中结核分枝杆菌药物耐受基因和/或其任意突变的方法，其包括：
[0015]1)提取所述样品中的DNA；
[0016]2)采用本申请第一方面所提供的引物组合物或本申请第二方面所提供的试剂盒，以所述DNA为模板进行多重PCR扩增；
[0017]3)将获得的扩增产物进行测序和序列比对，以获得结核分枝杆菌药物耐受基因和/或其突变的信息。
[0018]本申请的有益效果：本申请所提供的引物组合物能够一次扩增的目标基因覆盖了全部的已知15种可用于治疗结核分枝杆菌感染的药物的45个耐药基因的全长序列，不仅能够检测目前已知的突变，更重要的是还可以用于检测未知突变，检测覆盖度更广。此外，通过合理的引物设计，对引物的Tm值、GC含量、发夹结构、引物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其包含第一引物组合和第二引物组合，其中，所述第一引物组合包含：SEQ ID NO.1～392所示的引物，所述第二引物组合包含SEQ ID NO.393～784所示的引物。2.一种结核分枝杆菌药物耐受基因检测试剂盒，其包括权利要求1所述的引物组合物。3.权利要求1所述的引物组合物或权利要求2所述的试剂盒用于检测结核分枝杆菌药物耐受基因和/或其任意突变的用途。4.根据权利要求3所述的用途，其中所述结核分枝杆菌药物包括利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、左氧/莫西沙星、贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明、环丝氨酸、德拉马尼、阿米卡星、卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸的至少一种。5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述结核分枝杆菌药物耐受基因包括ald、alr、atpE、cycA、ddl、ddn、dfrA、eis、embA、embB、embC、embR、ethA、ethR、fbiA、fbiB、fbiC、fgd1、folC、gid、gyrA、gyrB、inhA、katG、panD、pepQ、pncA、ponA1、ribD、rplC、rpoA、rpoB、rpoC、rpsA、rpsL、rrl、rrs、Rv0678、Rv1979c、aftA、th...

【专利技术属性】
技术研发人员：李尉，宋佳平，黄一婷，王亮，韦玉倩，
申请(专利权)人：珠海碳华检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：