用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。该用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括上游引物、下游引物和探针。此外，本发明专利技术提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的荧光RPA试剂盒，包括上述RPA组合物。本发明专利技术还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：S1、提取待测样品DNA；S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物避光进行RPA扩增反应，并在扩增反应期间收集多次荧光信号，采集荧光数据，如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。该RPA组合物能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。

【技术实现步骤摘要】
用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)，属于诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)，是鱼类诺卡氏菌病的主要致病菌。鰤鱼诺卡氏菌可感染包括淡水养殖鱼种和海水养殖鱼种在内的40余种鱼类，如大口黑鲈(Micropterus salmoides)、罗非鱼(Oreochromis niloticus)、乌鳢(Channa argus)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)和大黄鱼(Larimichthys crocea)等。鱼体感染鰤鱼诺卡氏菌后的发病症状主要为肝脏、脾脏和肾脏组织形成大量白色结节。鰤鱼诺卡氏菌自然感染发病率可达到30％
‑
60％，患病鱼死亡率高，对水产养殖业造成了较大的经济损失。
[0003]由于鰤鱼诺卡氏菌感染早期为隐性感染，通常在中晚期才发现明显症状，所以需要对鰤鱼诺卡氏菌进行早期检测。此外，鰤鱼诺卡氏菌生长缓慢，因此从患病鱼体分离出鰤鱼诺卡氏菌的分离率较低，通过传统的细菌分离和生化鉴定准确率差。分子检测方法具有灵敏度高、时间短、操作简单等优点。目前已有报道基于分子技术检测鰤鱼诺卡氏菌的方法，如聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR反应和环介导等温扩增技术。然而，PCR和实时荧光定量PCR反应操作过程复杂、耗时且依赖于昂贵的设备(如PCR仪等)，不适合现场快速检测；环介导等温扩增技术需要在60
‑
65℃完成，需要水浴锅或恒温箱，且在此温度下反应容易因气溶胶污染产生假阳性，因此也不适宜鰤鱼诺卡氏菌的渔场检测。
[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种等温DNA扩增技术，与其他DNA扩增方法相比具有多项优势，特别是其可在非实验室环境下应用。重组酶聚合酶反应特异性强，可在25
‑
45℃的恒温条件下反应15
‑
30min即可实现特定核酸序列的扩增。该技术对硬件设备的要求很低，且反应时间短，无需对样品进行复杂处理，具有灵活性好和实用性强等优点，特别适用于渔场的病原检测，如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测是现有技术的难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服上述技术不足，提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物、荧光RPA试剂盒及检测方法，解决现有技术中如何实现鰤鱼诺卡氏菌的RPA检测的技术问题。
[0006]为达到上述技术目的，本专利技术的技术方案提供一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，包括上游引物、下游引物和探针；
[0007]所述上游引物和所述下游引物的寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
[0008]所述上游引物：
[0009]5’
GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC 3
’
；
[0010]所述下游引物：
[0011]5’‑
CAAAGATGCTCGCGTCCACTGTGCAGTTCTC
‑3’
；
[0012]所述探针的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3
’
端由C3 Spacer修饰；
[0013]所述探针：
[0014]5’‑
CACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTAC(FAM
‑
dT)C(THF)G(BHQ1
‑
dT)GACCGGTCGCGGTGGA(C3 Spacer)
‑3’
。
[0015]进一步地，本专利技术提出一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的荧光RPA试剂盒，所述荧光RPA试剂盒包括上述RPA组合物。
[0016]进一步地，所述荧光RPA试剂盒还包括阳性对照。
[0017]进一步地，所述阳性对照为鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA。
[0018]进一步地，所述荧光RPA试剂盒还包括核酸释放剂、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、反应体系缓冲液和醋酸镁。
[0019]进一步地，所述核酸释放剂的使用方法包括：取组织，加入水后充分研磨得到组织均浆液，取组织匀浆液到EP管中，加入核酸释放剂，混匀后静置得到产物，最后取所述产物进行实时荧光RPA检测。
[0020]此外，本专利技术还提出一种鰤鱼诺卡氏菌的检测方法，包括以下步骤：
[0021]S1、提取待测样品DNA；
[0022]S2、以步骤S1所提取的DNA为扩增模板，采用上述RPA组合物避光进行RPA扩增反应，并在扩增反应期间收集多次荧光信号，采集荧光数据，如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：本专利技术提出的用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物能够实现鰤诺卡氏菌的实时荧光RPA检测，能快速、简便、特异的检测鰤鱼诺卡氏菌。
附图说明
[0024]图1为引物和探针筛选的结果。1：F1/R1/probe；2：F1/R2/probe；3：F1/R3/probe；4：F2/R1/probe；5：F2/R2/probe；6：F2/R3/probe；7：阳性对照；8：F3/R1/probe；9：F3/R2/probe；10：F3/R3/probe；11：阳性对照；
[0025]图2为利用鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA检测实时荧光RPA灵敏度的结果。(A)PCR对不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的扩增结果，M：DL2000，1
‑
9的DNA浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl，10：阴性对照；(B)实时荧光RPA对不同浓度的鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的扩增结果，1
‑
9的DNA浓度分别为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl和1fg/μl，10：阴性对照。
[0026]图3为利用pMD18
‑
ITS质粒检测实时荧光RPA灵敏度的结果。(A)PCR对不同拷贝数的pMD18
‑
ITS质粒的扩增结果，M：DL2000，1
‑
8的质粒拷贝数分别为107copies/μl、
106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl、10copies/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌的RPA组合物，其特征在于，包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物和所述下游引物的寡核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述上游引物：5
’
GTAGTCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACACTGAC 3
’
；所述下游引物：5
’‑
CAAAGATGCTCGCGTCCACTGTGCAGTTCTC
‑3’
；所述探针的寡核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由四氢呋喃隔开，3
’
端由C3 Spacer修饰；所述探针：5
’‑
CACTGACAACCTTCATCGCACTCGATCGGTAC(FAM
‑
dT)C(THF)G(BHQ1
‑
dT)GACCGGTCGCGGTGGA(C3 Spacer)
‑3’
。2.一种用于检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永安，张旭杰，刘训，谭淑芳，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：