【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物。更具体地，涉及一株高效生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株。
技术介绍
1、抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质，具有很好的抗菌作用。但是，随着抗生素的广泛应用，抗生素耐药成为药物使用时应重点关注的问题。抗生素耐药指微生物阻止抗生素等药物对其产生作用的能力，致使标准治疗方法失去效力的现象。抗生素耐药已经成为严重的问题，同时也使得抗生素新药的开发存在着诸多挑战。
2、微菌素y(mccy)是一种来源于肠道菌的小分子抗菌肽，其通过与铁载体受体蛋白(fhua)结合进入细菌，对细菌进行内部瓦解，进而杀死细菌。mccy的发现极大地弥补了微菌素j25(部分大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和志贺氏菌)的抑菌谱，其主要针对鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌和婴儿沙门氏菌等血清型以及部分志贺氏菌和大肠杆菌。mccy的生物合成主要由mcyabcd四个基因参与，其中mcya编码mccy的线性氨基酸前体，mcyb、mcyc和mcyd编码翻译后修饰蛋白，转运蛋白以及分泌和自身免疫相关蛋白。
3、现有技术中都是在大肠杆菌中进行转化及表达mccy，虽然比微菌素j25聚具有更广的抑菌普，能有效抑制鼠伤寒沙门氏菌和婴儿沙门氏菌，但还存在一定的安全性问题，没办法直接生产应用。由大肠杆菌表达的mccy还需考虑肠杆菌科内毒素的影响，必须纯化去内毒素(这一步在生产过程中成本极高)，目前只能以药制剂应用；并且由于正常由革
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一株高效生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株。
2、本专利技术的目的是提供一株高效生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株。
3、本专利技术另一目的是提供所述工程菌株的构建方法。
4、本专利技术再一目的是提供枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株的应用。
5、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
6、本专利技术提供一株生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，通过在枯草芽孢杆菌野生型菌株上的α-淀粉酶基因amye位点和rna聚合酶σ-因子基因sigf位点上同时插入改造后的mcyabcd基因得到。所述改造后的mcyabcd基因中mcya和mcybcd的基因序列方向相同，分别由不同的启动子启动表达，mcya基因采用终止子终止转录，所述mcya的序列如seq id no：4所示，mcybcd的序列如seq id no：5所示，改造后的mcyabcd基因为seq id no：1-5的原件组合。
7、本专利技术通过对mcyabcd基因序列和表达原件的改造，使得mccy可以在枯草芽孢杆菌中成功表达，并将mcyabcd基因同时整合至枯草芽孢杆菌基因组两个位点中，得到一株可以高效生产mccy的枯草芽孢杆菌工程菌株byas2。
8、本专利技术针对的amye基因是枯草芽孢杆菌常用的高效稳定的整合位点，sigf基因是rna聚合酶sigma-f因子，是芽孢形成的关键因子，普遍存在于野生型枯草芽孢杆菌中；本专利技术通过将改造后的mcyabcd基因同时插入到这两个基因中，进行mccy的共表达后可以使其表达量上升，且高密度发酵过程中不会形成孢子，芽孢污染程度小，更有利于灭活菌。
9、特别地，本专利技术提供的方法能普遍适用于所有的野生型枯草芽孢杆菌(具有amye基因和sigf基因)，采用同源重组法进行产微菌素y的工程菌构建，得到mccy的高表达。
10、优选地，所述枯草芽孢杆菌原始菌株为枯草芽孢杆菌bs168野生菌株。
11、所述工程菌株的构建方法，包含如下步骤：
12、s1.改造微菌素y的mcyabcd基因：将mcya和mcybcd的基因序列调整为相同方向，由p43启动子启动mcya基因的表达，由pveg启动子启动mcybcd的表达，并且通过终止子对mcya基因进行终止转录，最后将改造后的mcyabcd基因转入载体中；
13、s2.将步骤s1含有改造后mcyabcd基因的载体，同时分别插入枯草芽孢杆菌的amye和sigf基因中，对微菌素y进行双位点的组成型表达，得到生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株。
14、进一步地，步骤s1中所述p43启动子的序列如seq id no：1所示，pveg启动子的序列如seq id no：2所示，终止子的序列如seq id no：3所示。
15、优选地，步骤s2中插入方法采用双交叉同源重组法。
16、更优选地，通过反向筛选技术，采用靶基因的上游同源臂、改造后的mcyabcd基因、抗生素基因、筛选基因和靶基因下游同源臂与质粒，通过重叠pcr和多片段无缝克隆技术，依次连接成重组整合质粒，然后转入枯草芽孢杆菌中，经过两轮筛选得到枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株。
17、优选地，所述抗生素为壮观霉素，质粒为pdg1730质粒，筛选基因为upp基因。
18、进一步地，所述靶基因amye上游同源臂的序列如seq id no：6所示，amye下游同源臂的序列如seq id no：7所示，靶基因sigf上游同源臂的序列如seq id no：8所示，sigf下游同源臂的序列如seq id no：9所示。
19、本专利技术还提供所述工程菌株在制备含微菌素y的微生物制剂中的应用。
20、本专利技术具有以下有益效果：
21、本专利技术提供一株高效生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，通过对mcyabcd基因序列和表达原件的改造，使得mccy可以在枯草芽孢杆菌中成功表达，并将改造后的mcyabcd基因同时整合至枯草芽孢杆菌基因组amye和sigf两个基因中，得到一株可以高效生产mccy的枯草芽孢杆菌byas2工程菌株，byas2工程菌株对mccy的表达量达到2.85mg/l(1.28μm)。与插入amye或sigf单一基因构建的工程菌的表达量1.2-1.8mg/l，以及在仅在质粒(pht43)中的表达量1.8-1.9mg/l相比，本专利技术构建的工程菌mccy的表达量提高了1倍左右。且本专利技术显示同时插入amye和sigf基因，能够使mccy的共表达量上升。同时，本专利技术提供的枯草芽孢杆菌byas2工程菌株的表达产物对鼠伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有良好的杀伤性，并且byas2工程菌株在高密度发酵过程中不会形成孢子产生芽孢，芽孢污染程度小，使得枯草芽孢杆菌byas2工程菌株在高温下可以失活，对于菌株的生长情况可以做到良好本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株高效生产微菌素Y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，其特征在于，所述工程菌株通过在枯草芽孢杆菌野生型菌株上的α-淀粉酶基因Amye和RNA聚合酶σ-因子基因SigF中同时插入改造后的mcyABCD基因得到，所述改造后的mcyABCD基因中mcyA和mcyBCD的基因序列方向相同，分别由不同的启动子启动表达，mcyA基因采用终止子终止转录。
2.根据权利要求1所述工程菌株，其特征在于，所述mcyA的序列如SEQ ID NO：4所示，mcyBCD的序列如SEQ ID NO：5所示。
3.根据权利要求1所述工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌野生型菌株为枯草芽孢杆菌BS168菌株。
4.权利要求1所述工程菌株的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S1中所述P43启动子的序列如SEQ ID NO：1所示，Pveg启动子的序列如SEQ ID NO：2所示，终止子的序列如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤S2中插入方法采用双交叉同源重组法。<...
【技术特征摘要】
1.一株高效生产微菌素y的枯草芽孢杆菌重组整合工程菌株，其特征在于，所述工程菌株通过在枯草芽孢杆菌野生型菌株上的α-淀粉酶基因amye和rna聚合酶σ-因子基因sigf中同时插入改造后的mcyabcd基因得到，所述改造后的mcyabcd基因中mcya和mcybcd的基因序列方向相同，分别由不同的启动子启动表达，mcya基因采用终止子终止转录。
2.根据权利要求1所述工程菌株，其特征在于，所述mcya的序列如seq id no：4所示，mcybcd的序列如seq id no：5所示。
3.根据权利要求1所述工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌野生型菌株为枯草芽孢杆菌bs168菌株。
4.权利要求1所述工程菌株的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤s1中所述p43启动子的序列如seq id no：1所示，pveg启动子的序列如seq id no：2所示，终止子的序列如seq id no：...
【专利技术属性】
技术研发人员：张广文，冯赛详，廖明，江金飞，谢倩梅，代绘琳，许斯祺，刘宇彤，孙娟，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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