【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及超分辨荧光显微，特别是涉及一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置与方法。
技术介绍
1、在活体细胞成像领域，光学显微技术以其无损、非接触成像的性质在众多方法中脱颖而出，而光学衍射极限的存在限制了其成像分辨率。为了实现对更小尺寸细胞及亚细胞级别生物样品的观察，提高光学显微技术的成像分辨率具有重要意义。
2、基于空间谱估计的超分辨荧光显微成像技术，通过对图像进行奇异值分解，划分信号与噪声子空间，利用成像系统的点扩散函数(psf)在不同特征向量上的投影比值来实现超分辨率成像，成像横向分辨率高，抑制噪声能力强，成像速度快，广泛应用于生命科学的许多领域。然而，因宽场照明条件下成像分辨率依赖于荧光波动，而特殊荧光染料标记具有较强的化学毒性和光毒性，不利于活体细胞成像。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置与方法，可以解决宽场照明依赖于荧光波动，而特殊荧光染料标记具有较强的化学毒性和光毒性的问题。
2、本专利技术采用的技术方案在于：
3、一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置，包括激光光源，沿激光光源的光线传播方向依次设有准直扩束镜、可旋转散射片、准直透镜、中继透镜、管镜、二向色镜、物镜、荧光样品、滤光片、集光透镜和相机。
4、激光光源出射光通过准直扩束镜后，入射至散射片表面，散射光经准直透镜、中继透镜会聚于管镜与中继透镜的公共焦面形成强度非均匀分布的散斑光场。管镜和物镜组
5、在散斑照明的条件下主动控制荧光闪烁，不依赖于荧光开关，荧光样品不具备独立闪烁的特性。
6、一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，包括以下步骤：
7、步骤s1，利用ccd相机采集由旋转散射片产生的不同散斑强度分布照明下生成的低分辨率图像序列；
8、步骤s2，利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，获得高分辨率图像。
9、进一步地，所述步骤s1具体包括：
10、激光光源出射光通过准直扩束镜后，入射至散射片表面，散射光经准直透镜、中继透镜会聚于管镜与中继透镜的公共焦面形成强度非均匀分布的散斑光场。管镜和物镜组成无限远成像系统，管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面，转动散射片可以改变物镜前焦面的散斑强度分布，对荧光样品进行随时间变化的非均匀激发。样品发出的荧光经物镜收集以及二向色镜和滤光片滤除杂散光后经集光透镜会聚于前焦面，相机感光平面与集光透镜前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。
11、低分辨率图像光强分布公式为：
12、
13、式(1)中，i(rs,r)为光强度，rs代表物空间坐标，r代表像空间坐标，o(r)代表荧光样品的物函数，h(r)表示系统的点扩散函数，t(rs)表示照射在样品表面的散斑强度分布，m代表系统的放大系数，w为假设的相机的像素尺寸，且w<<1.22λ/na，λ为激光光源的波长，na为物镜的数值孔径；(x,y)代表像空间坐标，m表示荧光样品中荧光探针个数。
14、进一步地，所述步骤s2具体包括：
15、将所述的低分辨率图像序列描述为数学矩阵的形式，第k帧低分辨率图像强度分布的矩阵公式为：
16、ik＝[ik(rs,r1) ik(rs,r2) ... ik(rs,rn)]t (2)
17、式(2)中，i为以列向量方式存储的序列中的每一帧图像，n为ccd相机的像素个数，r1，r2，rn代表像空间坐标；
18、低分辨图像序列组成矩阵i：
19、i＝[i1 i2 … ik] (3)
20、式(3)中，k表示采集的低分辨率图像总帧数；求其协方差矩阵：
21、r＝i*i' (4)
22、对矩阵r进行特征值分解，基于信息论方法中的最小描述长度准则(mdl)，根据成像系统噪声模型，通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号s:{uσi＝0}，其他特征向量代表n:{uσi＝0}；
23、求解点扩散函数在信号子空间、噪声子空间的特征向量上的投影分别为dpr(r′test)和dpn(r′test)：
24、
25、
26、式(5)中，dpr(r′test)为点扩散函数在信号子空间的特征向量上的投影，uσi＝0为奇异值对应的特征向量；
27、式(6)中，dpn(r′test)为点扩散函数在噪声子空间的特征向量上的投影；
28、dpr(r′test)和dpn(r′test)的比值为指示函数f(r′test)：
29、
30、式(7)中，α表示指示函数的指数因子，r′test为成像平面像素点坐标；
31、判别测试点有无荧光探针，当测试点为有荧光探针时，指示函数分母的值无限趋近于零，导致指示函数的值极大，否则指示函数的分子接近于0，指示函数的值较小，通常小于1，以指示函数的值为重构的结果，能清晰地区分出样品与背景噪声，提高图像分辨率。
32、利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，重构算法中输入的参数仅为荧光样品发射的荧光波长，物镜的数值孔径，物面的像素尺寸和像素细分倍数，不需要阈值的选取。
33、本专利技术的有益效果是：
34、利用散斑照明主动控制荧光闪烁，无需特殊荧光标记，不依赖于荧光开关，照明强度低，可以有效避免因特殊荧光染料标记引起的化学毒性和依赖于漂白过程荧光波动所引起的光毒性，提高了空间谱估计宽场照明超分辨显微成像技术的适用性。
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1.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，重构算法中输入的参数仅为荧光样品(9)发射的荧光波长，物镜(8)的数值孔径，物面的像素尺寸和像素细分倍数，不需要阈值的选取。
2.根据权利要求1所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，低分辨图像序列组成矩阵I，求其协方差矩阵：
3.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，在散斑照明的条件下主动控制荧光闪烁，不依赖于荧光开关，荧光样品(9)不具备独立闪烁的特性。
4.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置，用于实现权利要求1所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法。
6.根据权利要求5所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置，其特征在于，包括激光光源(1)，沿激光光源(1)光线传播方向依次设有准直扩束镜(2)，可旋转散射片(3)，准直透镜(4)，中继透镜(5)，管镜(6)，二向色镜(7)、物镜(8)，荧光样品(9)，滤光片(10)，
7.根据权利要求5所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置，其特征在于，激光光源(1)出射光通过准直扩束镜(2)后，入射至散射片(3)表面，散射光经准直透镜(4)、中继透镜(5)会聚于管镜(6)与中继透镜(5)的公共焦面形成强度非均匀分布的散斑光场。管镜(6)和物镜(8)组成无限远成像系统，管镜(6)的后焦面与物镜(8)前焦面为一组共轭面，转动散射片(3)可以改变物镜(8)前焦面的散斑强度分布，对荧光样品(9)进行随时间变化的非均匀激发。样品(9)发出的荧光经物镜(8)收集以及二向色镜(7)和滤光片(10)滤除杂散光后经集光透镜(11)会聚于前焦面，相机(12)感光平面与集光透镜(11)前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。
...【技术特征摘要】
1.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，利用空间谱估计对低分辨率图像序列进行重构，重构算法中输入的参数仅为荧光样品(9)发射的荧光波长，物镜(8)的数值孔径，物面的像素尺寸和像素细分倍数，不需要阈值的选取。
2.根据权利要求1所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，低分辨图像序列组成矩阵i，求其协方差矩阵：
3.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，在散斑照明的条件下主动控制荧光闪烁，不依赖于荧光开关，荧光样品(9)不具备独立闪烁的特性。
4.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置，用于实现权利要求1所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微方法。
6.根据权利要求5所述的一种空间谱估计散斑照明超分辨显微装置，其特征在于，包括激光光源(1)，沿激光光源(1)光线传...
【专利技术属性】
技术研发人员：张甦，肖彩妮，杜小渊，邹丽敏，丁雪梅，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：
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