【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及超分辨荧光显微，特别是涉及基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微装置与方法。
技术介绍
1、基于散斑照明的时间域去噪超分辨荧光显微成像技术，利用散斑照明主动控制荧光闪烁，无需特殊荧光标记，不依赖于荧光开关，照明强度低，可以有效避免因特殊荧光染料标记引起的化学毒性和依赖于漂白过程荧光波动所引起的光毒性，提高了基于空间谱估计的超分辨显微成像技术的适用性，而且利用奇异值分解得到的时间基向量，进而对低分辨率图像进行去噪，通过提高低分辨率图像信噪比，减小重构所需低分辨率图像。然而，散斑照明采用随机采样，照明不均匀，采样不充分导致重构图像失真。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微装置与方法，可以解决散斑照明采用随机采样，照明不均匀，采样不充分导致重构图像失真的问题。
2、本专利技术采用的技术方案在于：
3、基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微装置，包括激光光源，沿激光光源的光线传播方向依次设有准直扩束镜、反射镜、数字微镜(dmd)、扫描透镜、中继透镜、管镜、二向色镜、物镜、荧光样品、滤光片、集光透镜和相机。
4、激光光源出射光通过准直扩束镜后，由反射镜入射至dmd表面，dmd表面产生的点阵列图案使光束经过扫描透镜和中继透镜，会聚于管镜与中继透镜的公共焦面。其中管镜和物镜组成无限远成像系统，管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面，在物镜的前焦面产生多焦点照明，利用多焦点照
5、所述的扫描透镜5焦距为f1，中继透镜6焦距为f2，管镜7焦距为f3，物镜9焦距为f4，系统的放大率为：
6、
7、数字透镜阵列周期l为：
8、
9、其中di为多焦点照明的光斑间距。
10、基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，包括以下步骤：
11、步骤s1，相机配合dmd的时钟进行图像采集多焦点照明下的低分辨率图像序列，dmd的所有照明图案累积结果分布均匀；
12、步骤s2，利用空间谱估计对多焦点照明下且照明图案累积均匀的低分辨率图像序列进行重构，获得高时空分辨率图像。
13、进一步地，所述步骤s1具体包括：
14、激光光源出射光通过准直扩束镜后，由反射镜入射至dmd表面，dmd表面产生的点阵列图案使光束经过扫描透镜和中继透镜，会聚于管镜与中继透镜的公共焦面。其中管镜和物镜组成无限远成像系统，管镜的后焦面与物镜前焦面为一组共轭面，在物镜的前焦面产生多焦点照明，利用多焦点照明主动控制荧光闪烁。样品发出的荧光经物镜收集以及二向色镜和滤光片滤除杂散光后，经集光透镜会聚于其前焦面，相机感光平面与集光透镜前焦面重合而采集到荧光样品的成像结果。dmd产生与散斑照明相关长度相同的点阵列图案。通过改变dmd加载的反射图案，产生不同的点阵列图案可以改变物镜前焦面的强度分布，对荧光样品进行随时间变化的扫描，相机配合dmd的时钟进行图像采集，dmd的所有照明图案累积结果分布均匀。
15、利用多焦点照明主动控制荧光闪烁，所述的荧光样品可以具有独立闪烁的特性，也可以不具备独立闪烁的特性；
16、低分辨率图像光强分布公式为：
17、
18、式(3)中，i(rs,r)为光强度，rs代表物空间坐标，r代表像空间坐标，o(r)代表荧光样品的物函数，h(r)表示系统的点扩散函数，t(rs)表示照射在样品表面的多焦点照明强度分布，m代表系统的放大系数，w为假设的相机的像素尺寸，且w<<1.22λ/na，λ为激光光源的波长，na为物镜的数值孔径；(x,y)代表像空间坐标，m表示荧光样品中荧光探针个数。
19、进一步地，所述步骤s2具体包括：
20、将所述的低分辨率图像序列描述为数学矩阵的形式，第k帧低分辨率图像强度分布的矩阵公式为：
21、ik＝[ik(rs,r1) ik(rs,r2) ... ik(rs,rn)]t (4)
22、式(4)中，i为以列向量方式存储的序列中的每一帧图像，n为ccd相机的像素个数，r1，r2，rn代表像空间坐标；
23、低分辨图像序列组成矩阵i：
24、i＝[i1 i2 … ik] (5)
25、式(5)中，k表示采集的低分辨率图像总帧数；求其协方差矩阵：
26、r＝i*i' (6)
27、对矩阵r进行特征值分解，基于信息论方法中的最小描述长度准则(mdl)，根据成像系统噪声模型，通过最大似然估计得到信号特征值数量以确定视场内任意点的最佳信噪比阈值σ0。大于的σ0特征值对应的特征向量代表信号s:{uσi＝0}，其他特征向量代表n:{uσi＝0}；
28、求解点扩散函数在信号子空间、噪声子空间的特征向量上的投影分别为dpr(r′test)和dpn(r′test)：
29、
30、
31、式(7)中，dpr(r′test)为点扩散函数在信号子空间的特征向量上的投影，uσi＝0为奇异值对应的特征向量；
32、式(8)中，dpn(r′test)为点扩散函数在噪声子空间的特征向量上的投影；
33、dpr(r′test)和dpn(r′test)的比值为指示函数f(r′test)：
34、
35、式(9)中，α表示指示函数的指数因子，r′test为成像平面像素点坐标；
36、判别测试点有无荧光探针，当测试点为有荧光探针时，指示函数分母的值无限趋近于零，导致指示函数的值极大，否则指示函数的分子接近于0，指示函数的值较小，通常小于1，以指示函数的值为重构的结果，能清晰地区分出样品与背景噪声，提高图像分辨率。
37、本专利技术的有益效果是：
38、利用多焦点照明激发荧光，平均照明图案绝对均匀，可避免因散斑照明不均匀、采样不充分导致的图像失真，且具有与散斑照明相同的相关长度，可以具有相同的空间分辨率和更高的时间分辨率。此外，当光子预算相同时，在多焦点照明的条件下可以减少无效照明，提高图像的信噪比，最大程度避免光漂白，延长荧光探针的发光时间。
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1.基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，利用DMD(4)产生多焦点照明，利用多焦点照明主动控制荧光闪烁。DMD(4)产生与散斑照明相关长度相同的点阵列图案，通过改变DMD(4)加载的反射图案，可以改变荧光样品(10)表面的照明强度分布，实现随时间变化的扫描。
2.根据权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，利用多焦点照明主动控制荧光闪烁时，所述的荧光样品(10)可以具有独立闪烁的特性，也可以不具备独立闪烁的特性。
3.根据权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括：
5.基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微装置，用于实现权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法。
6.根据权利要求5所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微装置，其特征在于，包括激光光源(1)，沿激光光源(1)光线传播方向依次
7.根据权利要求5所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微装置，其特征在于，所述的扫描透镜(5)焦距为f1，中继透镜(6)焦距为f2，管镜(7)焦距为f3，物镜(9)焦距为f4，系统的放大率为：
...【技术特征摘要】
1.基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，利用dmd(4)产生多焦点照明，利用多焦点照明主动控制荧光闪烁。dmd(4)产生与散斑照明相关长度相同的点阵列图案，通过改变dmd(4)加载的反射图案，可以改变荧光样品(10)表面的照明强度分布，实现随时间变化的扫描。
2.根据权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，利用多焦点照明主动控制荧光闪烁时，所述的荧光样品(10)可以具有独立闪烁的特性，也可以不具备独立闪烁的特性。
3.根据权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的基于数字微镜的空间谱估计多焦点超分辨显微方法，其特征在于，所述步骤...
【专利技术属性】
技术研发人员：张甦，肖彩妮，杜小渊，邹丽敏，丁雪梅，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：
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