【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及杀菌的，尤其涉及一种新型环保材料螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法。
技术介绍
1、芽孢是由产芽孢杆菌在营养条件缺乏时进行高度脱水后产生的细菌休眠体，广泛存在于环境中，由于其独特的多层结构(孢外壁、芽孢衣、外膜、皮层、内膜、芽孢核等)保持了芽孢内部的水分含量并限制了有害物质的进入，使得它对于各种不利条件均具有高度抗逆性。此外，尽管芽孢在休眠状态下代谢并不明显，但其仍然能够能持续监测周围环境的营养状况，因此在适宜的环境条件下芽孢能够萌发并恢复生长，甚至在休眠了几万年以上还能够重新复活。
2、作为人类赖以生存和发展的重要物质前提，食品的质量安全直接影响国民身体健康及生命安全，而微生物导致的食品污染是威胁食品质量安全、造成食品工业中巨大经济损失的因素之一，其中芽孢因其高抗性及可复苏性成为了主要的微生物污染源，即在加工处理中芽孢极有可能存在于最终产品中，并在一定条件下萌发生长，最终导致食品腐败变质，甚至引起食源性疾病，给食品安全和保藏带来各种问题，因此，杀菌成为食品加工过程中的必要工序。
3、但目前食品工业中应用的传统杀菌方法如热杀菌(巴氏杀菌、高温瞬时杀菌等)虽有灭菌效果好、操作方便等优点，但由于高温可能会对食品品质产生影响，导致食品颜色变化、产生异味、营养损失等不良后果，同时高温杀菌具有污染环境、能源消耗量大等劣势，最重要的是热杀菌处理虽然可以杀灭致病菌以及其他有害微生物，但不足以杀灭抗逆性极强的细菌芽孢；而近年来新兴的非热杀菌技术如紫外线辐射技术、超高压技术等，虽然在处理过程中可以保
4、螯合树脂是一类以交联聚合物为骨架并连接有特殊螯合基团的功能高分子材料，其螯合基团的组成原子具有孤立电子对，能够通过配位键连接金属离子空的d轨道，从而螯合金属离子形成多元环状配位络合物，并在适当的条件下又能将螯合的金属离子释放出来。根据骨架所用的聚合物的不同可以将螯合树脂大体分为交联聚苯乙烯类、聚丙烯酸类、聚乙烯醇类以及天然高分子材料类如甲壳质类、淀粉类、纤维素类等。由于螯合树脂的骨架均为体形结构，不溶于酸、碱、水和其他有机溶剂，具有生产成本低、可连续再生使用等绿色环保的优势，并对重金属离子具有较好的分离与富集作用，且操作简单，因此近几年来在重金属废水处理方面、化工生产领域以及冶金工业中应用广泛，但尚未报道过将其应用于杀菌
中对芽孢的灭活。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术的首要目的是提供一种利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，该方法实现螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的新应用。
2、本专利技术的另一个目的是提供一种利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，该方法利用monoplus tp 208螯合树脂分别对蜡样芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、白色芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的芽孢进行快速有效的灭活，采用的螯合树脂monoplus tp 208产品标准属于食品级，生产成本低且能够进行再生处理后重新投入使用，实现了在操作简单、处理成本低的情况下，以绿色环保无污染的方式对芽孢进行有效的灭活。
3、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
4、一种利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，所述方法采用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行灭活。
5、具体包括以下步骤：
6、取离心管，加入螯合树脂，并用移液枪加入芽孢杆菌的菌悬液；
7、将离心管置于摇床上，在290r/min的转速下室温灭活15mins。
8、灭活结束后，用无菌滤网过滤掉实验组中的螯合树脂，收集滤液至新的离心管中，用移液枪移取滤液至离心管中，在5000rcf下离心5mins，去上清液，依次称取管中菌泥的重量，在暗环境下染色反应15mins后，进流式细胞仪测定分析。
9、申请人发现，螯合树脂所带的官能团是纳型的亚氨基二乙酸基团(na-ida)，如下所示：
10、
11、经过处理后，官能团中的大量na+被释放，对芽孢结构进行一定程度上的破坏，最终导致芽孢失活。由此，螯合树脂对于芽孢杆菌中的芽孢具有较高的灭活率。
12、所述芽孢杆菌，是蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、白色芽孢杆菌(bacillus albus)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的任意一种及任意组合。
13、进一步，取4根50ml的离心管，各加入10g的螯合树脂，并用移液枪(2-10ml)1:2(树脂重量：菌悬液体积)的比例分别加入四株菌的菌悬液20ml(×4)。
14、进一步，上述菌株需要进行培养及芽孢的诱导生成，具体包括如下步骤：
15、对四株目标菌进行活化与扩培，从菌库中取出四株目标菌的菌株甘油管(保藏温度：-80℃；保护液配方：50％甘油/菌液＝1:1)，在冰块中缓慢解冻后，用接种环蘸取菌液，分别在已配好的bhis固体培养基上进行三区划线活化，并置于37℃的培养箱中好氧培养24h，生长至出现每个菌对应的形态与色泽的单菌落后，以此作为活化一代，然后分别挑取各平板上的数个单菌落接种于已配好的bhis液体培养基中，置于37℃、200r/min的摇床中好氧培养24h，生长至各菌液浑浊后，说明扩培完成，以此作为活化二代；
16、诱导四株目标菌的芽孢生成，将四瓶活化二代的菌液于4℃的冰箱中厌氧放置24h后，用移液枪各移取至离心管中，在7000rcf下离心5分钟，倒上清液，去除培养基成分，再分别加入生理盐水涡旋混匀后，每根离心管滴入1-2滴的孔雀绿染料，再次涡旋保证染料充分与菌液接触后，于沸水中放置15mins，一方面杀灭大部分菌营养体，另一方面保证孔雀绿染料完全进入菌体内的芽孢中，取出离心管，用移液枪各移取20μl的染料菌液复合体至四块无菌载玻片上，在酒精灯上烘干后，用去离子水水洗，将染上孔雀绿的菌体脱色，用吸水纸擦干后，于染色区上分别加入1-2滴沙黄染料，静置30s，对被脱色的菌体进行复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，从而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
17、更进一步，需要确定四株目标菌的菌量是否位于同一数量级上，否则应进行进一步的稀释处理。首先将四份菌液在7000rcf下离心5分钟，倒上清液，去除培养基成分，该操作一方面避免培养基成分对试验结果产生影响，另一方面防止在试验过程中芽孢复苏进行生长繁殖导致试验结果不准确。收集沉淀的四份菌泥称重后用生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于所述方法采用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行灭活。
2.根据权利要求1所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于所述芽孢杆菌，是蜡样芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、白色芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的任意一种及任意组合。
4.根据权利要求3所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于取4根50ml的离心管，各加入10g的螯合树脂，并用移液枪(2-10ml)1:2(树脂重量：菌悬液体积)的比例分别加入四株菌的菌悬液20ml(×4)。
5.根据权利要求4所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于上述菌株需要进行培养及芽孢的诱导生成，具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于需要确定四株目标菌的菌量是否位于同一数量级上，首先将四份菌液在7000rcf
7.根据权利要求1所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在所述螯合树脂，为MonoPlus TP 208螯合树脂，其官能团为亚氨基二乙酸。
8.根据权利要求7所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于螯合树脂需要对其进行前处理；首先用去离子水洗去小粒子和破碎树脂后，在2BV(1BV＝1个单位的树脂体积)的10％NaCl溶液中浸泡20小时，浸泡完毕后用6BV的去离子水冲洗干净，随后再用4BV的75％乙醇溶液浸泡12小时，去除其中的气泡，使树脂充分膨胀收缩，最后用6BV的去离子水再次冲洗干净。
9.根据权利要求8所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于使用后的螯合树脂需要进行两次酸碱的交叉再生方可使用，具体包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于所述方法采用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行灭活。
2.根据权利要求1所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于所述芽孢杆菌，是蜡样芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、白色芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的任意一种及任意组合。
4.根据权利要求3所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于取4根50ml的离心管，各加入10g的螯合树脂，并用移液枪(2-10ml)1:2(树脂重量：菌悬液体积)的比例分别加入四株菌的菌悬液20ml(×4)。
5.根据权利要求4所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于上述菌株需要进行培养及芽孢的诱导生成，具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的利用螯合树脂对芽孢杆菌中的芽孢进行有效灭活的方法，其特征在于需要确定四株目标菌的菌量是否位于同一数量级上，首先将四份菌液在7000rcf下离心5分钟，倒上清液，去除培...
【专利技术属性】
技术研发人员：李源涛，林振雄，徐炜，张帮周，何剑全，肖传兴，
申请(专利权)人：上海承葛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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