【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种自环化rna(automatic circulatingrna，acrna)，环状rna及其制备方法。
技术介绍
1、环状rna(circular rna，circrna)是一类不具有5'端帽子和3'端polya尾巴，且5'端与3'端以共价健形成环状结构的rna分子。有报道称circrna可参与调节基因转录、mirna活性的中和以及rna结合蛋白的结合，也可作为模板翻译成蛋白质(yang,y.,et al.,“extensive translation of circular rnas driven by n(6)-methyladenosine,”,cellresearch,27(5):626-641(2017)；abe,n.,et al.,“rolling circle translation ofcircular rnain living human cells”,scientific reports,5:16435(2015)；gao,x.,etal.,“circular rna-encoded oncogenic e-cadherin variant promotes glioblastomatumorigenicity through activation of egfr-stat3signalling,”nature cellbiology,23(3):278-291(2021)；pamudurti,nr.,et al.,“translation of circrnas,”molec
2、近年来，人们对开发circrna的合成技术越来越感兴趣。排列内含子和外显子法(permuted introns and exons，pie)是目前研究最多、应用最广泛的circrna合成方法。2018年，daneil aderson等人利用改良的pie法证实外源性circrna可在真核细胞中稳定、高效表达蛋白(anderson,d.,et al.,“engineering circular rna for potent andstable translation in eukaryotic cells”,nat commun.2018jul 6；9(1):2629)。然而，由于pie法是通过自发的分子内共价连接反应生成circrna，其反应特点使之也可能发生分子间连接产生副产物，且连接效率低，环化效率不稳定。随着目标rna的长度增长，环化成功率会大幅下降，副产物大量增加。此外，为除去非环化的rna和富集circrna，一般还需要通过rnase r将未环化的rna去除。但是由于环状rna和线性的rna性质接近，很难在分离柱上获得基线分离，加之rnase r常残留对环状rna非特异的降解活性，使得在体外大规模制备环状rna存在很高的成本，且因难以避免的质控副产物和富集步骤带来的降解产物以及额外的rnase r酶残留，环状rna的商业化质控也面临很大挑战。
3、除此之外，已有研究通过利用后生动物的trna内含子环化机制，在体外或细胞内合成短小的环状rna适配体(rna aptamer)，有效提高了rna适配体调节蛋白质的功能(litke jl,jaffrey sr.highly efficient expression of circular rna aptamers incells using autocatalytic transcripts.nat biotechnol.2019jun；37(6):667-675.)。该方法可实现短小rna的环化，然而该方法目前只用于短小的rna适配体(broccoli，长度仅49nt)的环化，此外，该方法使用的是果蝇trna的部分序列，特别是该trna的内含子部分，这些非人源化的序列存在一定的潜在安全性风险，比如可能引入额外的免疫原性反应，或干扰细胞内其他内源性rna的正常功能。因此，如何设计出成本更低、高品质和更安全可用于长序列基因表达的环化rna，仍是本领域亟待解决的问题。
4、以上提及的文献均以全文引入本文。
技术实现思路
1、本专利技术发现，人源trna的有效序列可进行细胞内的自环化，并构建了通用型自环化rna(automatic circulating rna，acrna)的框架模板，可方便的用于制备不同大小的自环化rna。本专利技术通过利用细胞内天然的trna剪接机制，可以在细胞内进行rna高效的自环化，无需进行体外环化和富集，极大的降低了现有pie等体外环化方法的高成本和纯化难度。同时，由于本专利技术采用了人源化的trna序列，也降低了潜在的安全性风险。本专利技术提供的含人源trna部分序列的acrna，还可携带长序列的目的基因片段，可成功用于蛋白质稳定表达、基因编辑，rna编辑等多种应用。
2、如本文所用，转运核糖核酸(transfer ribonucleic acid，trna)是一种比较小的rna，成熟的trna一般由74-93个核苷酸构成，其二级结构为四茎三环的三叶草结构，三环即d环、反密码子环和tψc环，四个茎，即d茎(与d环联接的茎)、反密码子茎(与反密码子环联接)、tψc茎(与tψc环联接)和氨基酸接受茎，如图1a所示。trna基因可根据其是否含有内含子分为两类，其中含有内含子的trna基因首先转录出含内含子的trna前体，除了上述茎/环结构外(除尚未形成的反密码子环外)，还含有内含子茎和内含子环(如图1b所示)，在转录出前体trna后的成熟过程中，前体trna(precursor trna，pre-trna)需要经过一系列转录后加工和修饰，去掉内含子部分，形成反密码子环，完成碱基修饰后才能生成成熟的trna。在pre-trna的成熟过程中，至关重要的一步是“trna剪接”，用于除去内含子和把外显子连接起来。剪接后，外显子一侧会形成反密码子环，内含子一侧的内含子茎的游离端也会被连接起来形成一个小的环状rna，如图1b所示。在已知的生物中，原核和真核生物中均发现有一部分trna基因存在内含子，这些内含子序列必须经过trna剪接被精确地去除。目前发现的人类trna基因中，含有内含子的trna根据其反密码子和可携带的氨基酸残基可分为7类：人源trnatyr-gta(seq id no：1～13)、trnatyr-ata(seq id no：14)、trnaile-tat(seqid no：15～19)、trnaarg-tct(seq id no：20～23)、trnaleu-caa(seq id no：24～28)、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种自环化RNA的前体RNA，其中，所述前体RNA从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：
2.如权利要求1所述的前体RNA，其中，所述前体RNA从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：
3.如权利要求1或2所述的前体RNA，其中，所述5'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件和所述3'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件的所述人源tRNA的序列包含至少部分互补并能够至少形成人源tRNA的反密码子茎的至少一部分、优选全部的核苷酸序列。
4.如权利要求1或2所述的前体RNA，其中，所述5'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件和所述3'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件的所述人源tRNA的序列包含至少部分互补并能够形成人源tRNA的内含子茎的至少一部分、优选全部的核苷酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的前体RNA，其中，所述核酶识别序列包含自剪切RNA核酶序列或与DNA核酶互补的序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的前体RNA，其中，所述人源tRNA选自人源tRNATyr-GTA、tRNATyr-ATA、tRNAIl
7.如权利要求1-6任一项所述的前体RNA，其中：
8.如权利要求1-6任一项所述的前体RNA，其中：
9.如权利要求8所述的前体RNA，其中，对应所述5'端的DNA核酶包含SEQ ID NO:35所示的序列，和/或对应所述3'端的DNA核酶包含SEQ ID NO:36所示的序列。
10.一种自环化RNA，其中，所述自环化RNA为权利要求1至9任意一项所述的前体RNA经自剪切RNA核酶或DNA核酶剪切后形成的自环化RNA，所述自环化RNA的5'端剪切后形成羟基，3'端剪切后形成2',3'-环磷酸。
11.如权利要求10所述的自环化RNA，其中，所述自环化RNA从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：
12.如权利要求11所述的自环化RNA，其中，所述自环化RNA为以下结构：
13.如权利要求10-12任一项所述的自环化RNA，其中，
14.如权利要求10-13任一项所述的一种自环化RNA，其中，
15.一种环状RNA，其中，所述环状RNA为权利要求10-14中任意一项所述自环化RNA在RNA连接酶的存在下自环化形成的环状RNA。
16.一种环状RNA，其中，所述环状RNA顺序包含以下结构域：
17.如权利要求16所述的环状RNA，其中，所述5'端人源tRNA序列与所述3'端人源tRNA序列均为同一人源tRNA的部分序列，且所述5'端人源tRNA序列与所述3'端人源tRNA序列包含部分互补并能够形成至少一个所述人源tRNA的反密码子茎或内含子茎的核苷酸序列。
18.如权利要求16或17所述的环状RNA，其中，所述人源tRNA选自人源tRNATyr-GTA、tRNATyr-ATA、tRNAIle-TAT、tRNAArg-TCT、tRNALeu-CAA、tRNAPro-AGG、tRNAPhe-GAA中的一或多种。
19.一种用于产生前体RNA的核酸载体，其中，所述核酸载体包含编码权利要求1-9中任意一项权利要求所述的前体RNA的序列。
20.一种用于产生前体RNA的核酸载体，其中，所述核酸载体按顺序包含以下元件的编码序列：
21.如权利要求20所述的核酸载体，其中，所述5'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件与所述3'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件均包含核酶识别序列和人源tRNA的部分序列，优选所述5'端和3'端的人源tRNA的部分序列至少包含能够部分互补并形成反密码子茎或内含子茎的序列。
22.如权利要求20或21所述的核酸载体，其中，所述人源tRNA为人源tRNATyr-GTA、tRNATyr-ATA、tRNAIle-TAT、tRNAArg-TCT、tRNALeu-CAA、tRNAPro-AGG、tRNAPhe-GAA中的一或多种。
23.如权利要求20-22任一项所述的核酸载体，其中，所述5'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件和所述3'端基于人源tRNA设计的核酶剪接元件包括自剪切核酶序列。
24.如权利要求23所述的核酸载体，其中，所述自剪切核酶选自RNA酶P、rRNA、引导酶、I组内含子核酶、II组内含子核酶、GIR1分支核酶、glmS核酶、发夹核酶、锤头状核酶、HDV核酶、绕线核酶、绕线姐妹核酶、VS核...
【技术特征摘要】
1.一种自环化rna的前体rna，其中，所述前体rna从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：
2.如权利要求1所述的前体rna，其中，所述前体rna从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：
3.如权利要求1或2所述的前体rna，其中，所述5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件和所述3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的所述人源trna的序列包含至少部分互补并能够至少形成人源trna的反密码子茎的至少一部分、优选全部的核苷酸序列。
4.如权利要求1或2所述的前体rna，其中，所述5'端基于人源trna设计的核酶剪接元件和所述3'端基于人源trna设计的核酶剪接元件的所述人源trna的序列包含至少部分互补并能够形成人源trna的内含子茎的至少一部分、优选全部的核苷酸序列。
5.如权利要求1-4任一项所述的前体rna，其中，所述核酶识别序列包含自剪切rna核酶序列或与dna核酶互补的序列。
6.如权利要求1-5任一项所述的前体rna，其中，所述人源trna选自人源trnatyr-gta、trnatyr-ata、trnaile-tat、trnaarg-tct、trnaleu-caa、trnapro-agg或trnaphe-gaa中的一或多种。
7.如权利要求1-6任一项所述的前体rna，其中：
8.如权利要求1-6任一项所述的前体rna，其中：
9.如权利要求8所述的前体rna，其中，对应所述5'端的dna核酶包含seq id no:35所示的序列，和/或对应所述3'端的dna核酶包含seq id no:36所示的序列。
10.一种自环化rna，其中，所述自环化rna为权利要求1至9任意一项所述的前体rna经自剪切rna核酶或dna核酶剪切后形成的自环化rna，所述自环化rna的5'端剪切后形成羟基，3'端剪切后形成2',3'-环磷酸。
11.如权利要求10所述的自环化rna，其中，所述自环化rna从5'至3'方向按顺序包含以下结构域：
12.如权利要求11所述的自环化rna，其中，所述自环化rna为以下结构：
13.如权利要求10-12任一项所述的自环化rna，其中，
14.如权利要求10-13任一项所述的一种自环化rna，其中，
15.一种环状rna，其中，所述环状rna为权利要求10-14中任意一项所述自环化rna在rna连接酶的存在下自环化形成的环状rna。
16.一种环状rna，其中，所述环状rna顺序包含以下结构域：
17.如权利要求16所述的环状rna，其中，所述5'端人源trna序列与所述3'端人源trna序列均为同一人源trna的部分序列，且所述5'端人源trna序列与所述3'端人源trna序列包含部分互补并能够形成至少一个所述人源trna的反密码子茎或内含子茎的核苷酸序列。
18.如权利要求16或17所述的环状rna，其中，所述人源trna选自人源trnatyr-g...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，赵晟，马钱波，唐传青，
申请(专利权)人：南京鸿明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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