【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种检测mrna的polya尾长度的方法。
技术介绍
1、在真核生物中，大多数mrna分子在3'末端被多聚腺苷酸化，形成的polya尾巴和与其结合的蛋白质有助于保护mrna免于被核酸外切酶降解。3'端加尾对于转录终止、从细胞核输出mrna和翻译也很重要。polya长度被发现和mrna的翻译与稳定性密切相关（nicholson, angela l.; pasquinelli, amy e.trends in cell biology (2019), 29(3), 191-200）。早期人们认为，polya越长越能保护mrna不被降解，但随着研究的深入，特别是针对polya的测序技术发展，人们发现真相可能不像想象中那样简单。一些研究表明，相对较短的polya通常出现在高表达的、翻译效率较高mrna中，而较长的polya则更多出现地在低丰度的、翻译效率较低的mrna中。同时，polya长度似乎与其在胞内的半衰期呈负相关。
2、mrna药物，在体外制备mrna时，通常会采用两种方法将polya添加到rna 3'端：（1）在体外转录模板上设计固定长度的polya序列，通过体外转录直接添加；（2）在转录完成后用polya聚合酶添加。由于两种方法所用酶的特性，rna产物中polya的长度不可避免地会出现参差不齐的情况。鉴于polya长度对于mrna药物的重要性，各国药监机构出台的mrna药物指导原则中均规定需要对mrna的polya长度进行严格地检测。
3、中国专利cn105734053b公
4、中国专利cn110452951b公开了一种“监测mrna polya尾长度的方法及应用”，该专利提供了一种监测mrna polya尾长度的方法，该方法通过测定标准加尾反应中不同反应时间点的atp消耗量和/或ppi生成量，绘制出标准mrna加尾长度和反应时间的标准曲线，然后通过待测mrna反应液中atp消耗量，来确定mrna polya加尾长度。然而，该方法的原理是基于生化反应动力学的统计学计算间接推断polya的个数，其结果是化学反应的平均结果，难以直接判断样品中polya的长度范围，且仅适用于需要单独进行加尾反应的mrna合成或生产流程，并不适合目前工业生产中普遍采用的把polya直接放到转录模板质粒中的生成策略，并且该方法使用过程中，一旦体系中各个物料发生变化时，均会对检测结果产生影响。
5、目前其他测定mrna polya尾长度的方法还包括：northern印迹法、lc-ms法等，这些方法也有各自优点和适用的局限性。比如northern印迹法相对简单，但属于半定量方法，不够准确；lc-ms方法测分子量的精确度高，但成本昂贵，其结果也基于统计学的计算，难以直接判断样品中polya的长度范围。因此，开发一套实验流程既简单、经济、又能准确直接定量的检测mrna样品中polya尾长度范围的方法，是mrna药物研究和药物生产质检方法学面临的挑战之一。
技术实现思路
1、在一方面，本专利技术提供了一种检测rna polya长度的方法，包括如下步骤：
2、1)采用具rna剪切活性的dna核酶特异性剪切mrna，生成带有polya结构的rna片段以及不带有 polya结构的rna片段；
3、mrna包括天然的含有polya尾的mrna或者人工合成的含有polya尾的mrna。utr（untranslated regions）即非翻译区，是信使rna（mrna）分子两端的非编码片段。5'-utr从mrna起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至aug起始密码子，3'-utr从编码区末端的终止密码子延伸至多聚a尾巴（poly-a）之前。原核生物和真核生物的mrna中都存在非编码区域（utr），但它们的长度和组成都有所不同。原核生物中，5'非翻译区通常为3至10个核苷酸残基的长度。但在真核生物中，5'非翻译区可以长达成百上千个核苷酸残基的长度。与原核生物相比，真核生物的基因组的复杂性更高，3'非翻译区的长度也不同。
4、由于mrna的3'端utr区并不固定，因此为了使检测结果更加精确，针对不同的3'端utr区，需要对特定位点的具rna剪切活性的dna核酶进行设计和/或对该剪切位点进行筛选，从中获得最优的dna核酶，本专利技术提供的具体3'端utr区及对应设计的dna核酶，并不限制本专利技术的保护范围，任何3'端utr区及任何能够特异性有效切割3'端utr区的dna核酶均可应用于本专利技术提供的检测方法。
5、本申请提供的检测方法，筛选出能够特异性定点切割mrna的dna核酶，其切割位点位于3'-utr区的包括polya尾在内不超过200个碱基的位点。当切割后的带有polya结构的rna片段碱基数超过200时，毛细管电泳仪的检测结果精度会随着碱基个数的增加而逐渐下降。
6、在一些实施方式中，剪切酶为能够特异性切割rna的脱氧核酶，具体地，可以是脱氧核酶dnazyme(10-23)、dnazyme(8-17)。在一些实施方式中，剪切酶为dnazyme(10-23)，在一些实施方式中，剪切酶为dnazyme(8-17)。在一些实施方式中，dnazyme(10-23)或dnazyme(8-17)的两臂臂长可以在7~15 nt范围，本实施方案中优选为14 nt。本申请提供的核酶并不对本申请进行限制。任何与本申请提供的utr序列不相同或相似的序列也可通过本申请提供的方法筛选出合适的核酶并进行下一步的检测。
7、在一些实施方式中，mrna 的3'端的utr区包括seq id no: 1所示序列，剪切酶为dnazyme(8-17)或dnazyme(10-23)。
8、5'-ctcgagctggtactgcatgcacgcaatgctagctgcccctttcccgtcctgggtaccccgagtctcccccgacctcgggtcccaggtatgctcccacctccacctgccccactcaccacctctgctagttccagac本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测mRNA的3'端polyA结构长度的方法，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述mRNA选自天然的含有polyA结构的mRNA和人工合成的含有polyA结构的mRNA。
3.如权利要求1所述的方法，其中，采用磁珠法提取带有所述polyA结构的RNA片段。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述具RNA剪切活性的DNA核酶为能够特异性切割mRNA的脱氧核酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述脱氧核酶为DNAzyme(10-23)。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述脱氧核酶为DNAzyme(8-17)。
7.如权利要求1所述的方法，其中，当所述mRNA 的3'端的UTR区包括SEQ ID NO: 1所示序列时，所述具RNA剪切活性的DNA核酶为脱氧核酶DNAzyme(8-17)。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述脱氧核酶DNAzyme(8-17)的序列如SEQ ID NO:11所示。
9. 一种mRNA polyA结构长度检测试剂盒，其包括序列
10.如权利要求9所述的mRNA polyA结构长度检测试剂盒，其中，所述mRNA包括SEQ IDNO: 1所示序列的UTR区。
...【技术特征摘要】
1.一种检测mrna的3'端polya结构长度的方法，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述mrna选自天然的含有polya结构的mrna和人工合成的含有polya结构的mrna。
3.如权利要求1所述的方法，其中，采用磁珠法提取带有所述polya结构的rna片段。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述具rna剪切活性的dna核酶为能够特异性切割mrna的脱氧核酶。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述脱氧核酶为dnazyme(10-23)。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述脱氧核酶为dnazyme(8-17)。...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，赵晟，孙叶，
申请(专利权)人：南京鸿明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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