【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种m-mlv抗体及其在m-mlv反转录酶制备中的应用。
技术介绍
1、反转录酶包括两种，一种为禽成纤维病毒amv，它的rnaseh活性高，cdna合成效率低，一般不常用；另一种是莫洛尼鼠白血病病毒m-mlv，广泛应用于荧光定量pcr检测中。目前很多厂家专注于通过突变提高m-mlv的合成效率、耐热性等性能，但本室研究发现，同样的基因表达出来的重组m-mlv，经过不同的纯化方法纯化得到的酶活及灵敏度等相差极大。
2、本领域生产的m-mlv逆转录酶制备基本上是通过将m-mlv基因重组至带有his标签的原核表达载体中，诱导其在大肠杆菌中表达再经过镍柱等纯化方法制备而成。对于重组蛋白来说，为了纯化一般会加入纯化标签，其中his最常见，虽说标签越小对蛋白活性影响越小，但对酶这种活性要求较高的重组蛋白无标签的天然状态显然是最好的；此外镍柱纯化过程中，难免出现金属离子脱落，可能产生重组酶聚集现象；再有就是镍柱会非特异性吸附原核表达宿主蛋白，降低目的蛋白的纯度；此外，m-mlv水溶性低，稳定性较差，纯化过程中需要添加一些助溶剂如二硫苏糖醇等，而常用的镍柱对dtt是不耐受的，因而影响重组酶的纯化。
3、m-mlv逆转录酶应用非常广泛，除了应用于常见的体外诊断荧光定量pcr平台，rna测序、文库构建、基因表达芯片等都会出现m-mlv的身影，对m-mlv的效率和灵敏度要求也越来越高。目前m-mlv逆转录酶纯化方法大同小异，纯化获得的m-mlv通常具有稳定性差、易降解、耐热性差等缺点。实际上好的纯
4、因此，本专利技术公开了一种m-mlv逆转录酶抗体及其制备的m-mlv亲和柱，能特异性吸附m-mlv逆转录酶，两步即可获得高纯度高活性且高稳定性的m-mlv逆转录酶，同时还缩短了生产周期节约了人力成本，对重组m-mlv逆转录酶稳定规模化生产具有重要意义。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术通过杂交瘤制备技术筛选得到了30株杂交瘤细胞，通过层层筛选获得了3株能偶联到亲和树脂上并特异性结合m-mlv逆转录酶的抗体，其中一株抗体亲和柱纯化得到的酶活性最高，该抗体由杂交瘤细胞株j9-5产生。所述单克隆抗体制备的亲和柱纯化得到的m-mlv逆转录酶纯度达90％以上，能达到预期检测要求，性能优于进口m-mlv逆转录酶。
2、本专利技术所采取的技术方案是：
3、本专利技术的第一方面，提高一种m-mlv单克隆抗体，所述m-mlv单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区；
4、所述轻链可变区的氨基酸序列为：
5、a)seq id no.1；或
6、b)seq id no.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列；
7、所述重链可变区的氨基酸序列为：
8、a)seq id no.2；或
9、b)seq id no.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰后且功能相同或相似的氨基酸序列。
10、优选地，所述单克隆抗体由保藏编号为cctcc no:c2023207的杂交瘤细胞株j9-5产生。
11、本专利技术的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子包括本专利技术第一方面所述的单克隆抗体的编码基因。
12、优选地，所述编码本专利技术第一方面所述轻链可变区的核苷酸序列为：
13、a)如seq id no.3所示的核苷酸序列；或
14、b)将seq id no.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seqid no.3所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。
15、所述编码本专利技术第一方面所述重链可变区的核苷酸序列为：
16、a)如seq id no.10所示的核苷酸序列；或
17、b)将seq id no.10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加，且与seqid no.10所示的核酸分子编码相同蛋白的核苷酸序列。
18、本专利技术的第三方面，提供一种载体，所述载体包含本专利技术第二方面所述的核酸分子。
19、本专利技术的第四方面，提供一种细胞，所述细胞包含本专利技术第三所述的载体。
20、优选地，所述细胞非植物动物品种。
21、本专利技术的第五方面，提供本专利技术第一方面所述单克隆抗体或本专利技术第二方面所述核酸分子或本专利技术第三方面所述载体或本专利技术第四方面所述细胞在制备m-mlv反转录酶或生产制备m-mlv反转录酶的产品中的应用。
22、本专利技术的第六方面，提供一种产品，所述产品包含本专利技术第一方面所述单克隆抗体或本专利技术第二方面所述核酸分子或本专利技术第三方面所述载体或本专利技术第四方面所述细胞。
23、优选地，所述产品还包括亲和柱。
24、优选地，所述亲和柱的填料包括亲和树脂，但并不局限于此，常用的能与蛋白质、抗体结合的填料均可达到同样的效果。
25、优选地，所述亲和树脂包括溴化氢活化的琼脂糖。
26、优选地，所述单克隆抗体和填料的比例为15～25mg(抗体)/ml填料。
27、优选地，所述产品还包括分离纯化m-mlv反转录酶所需要的常规试剂。
28、本专利技术的第七方面，提供一种制备m-mlv反转录酶的方法，包括使用本专利技术第六方面所述的产品制备m-mlv反转录酶。
29、优选地，所述方法具体包括：
30、s1：将所述单克隆抗体与亲和柱中的亲和树脂偶联制备m-mlv单克隆抗体亲和柱；
31、s2：使用m-mlv单克隆抗体亲和柱纯化m-mlv反转录酶。
32、本专利技术的有益效果是：
33、本专利技术提供了一种m-mlv单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株j9-5，所述m-mlv反转录酶单克隆抗体可特异性结合m-mlv反转录酶并在其制备的亲和柱纯化过程中提高m-mlv反转录酶的纯度及活性，用该法制备得到的m-mlv反转录酶对临床样本的扩增效率有明显的提高，而且极大简化了m-mlv反转录酶制备过程，有效地缩短了实验周期且较大地节约了生产成本。制备所得的m-mlv反转录酶可广泛应用于qrt-pcr检测等分子诊断领域中。
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1.一种M-MLV单克隆抗体，所述M-MLV单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区；
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2023207的杂交瘤细胞株J9-5产生。
3.一种核酸分子，所述核酸分子包括权利要求1～2任一项所述的单克隆抗体的编码基因；优选地，所述编码权利要求1所述轻链可变区基因的核苷酸序列为：
4.一种载体，所述载体包含权利要求3或4所述的核酸分子。
5.一种细胞，所述细胞包含权利要求4所述的载体。
6.权利要求1或2所述单克隆抗体或权利要求3所述核酸分子或权利要求4所述载体或权利要求5所述细胞在制备M-MLV反转录酶或生产制备M-MLV反转录酶的产品中的应用。
7.一种产品，所述产品包含权利要求1或2所述单克隆抗体或权利要求3所述核酸分子或权利要求4所述载体或权利要求5所述细胞。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品还包括亲和柱；优选地，所述亲和柱的填料包括亲和树脂。
9.一种纯化M-MLV反转录酶的
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：
...【技术特征摘要】
1.一种m-mlv单克隆抗体，所述m-mlv单克隆抗体包含轻链可变区和重链可变区；
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏编号为cctcc no:c2023207的杂交瘤细胞株j9-5产生。
3.一种核酸分子，所述核酸分子包括权利要求1～2任一项所述的单克隆抗体的编码基因；优选地，所述编码权利要求1所述轻链可变区基因的核苷酸序列为：
4.一种载体，所述载体包含权利要求3或4所述的核酸分子。
5.一种细胞，所述细胞包含权利要求4所述的载体。
6.权利要求1或2所述单克隆抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：李小锋，李晨阳，李园枚，
申请(专利权)人：广州锐达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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