一种高危型HPV荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种高危型ＨＰＶ的荧光ＰＣＲ筛查方法及其引物、探针和试剂盒。该方法针对高危型ＨＰＶ基因序列，采用多重ＰＣＲ分三管同时进行。反应条件为９０－９５℃１－５分钟，热循环为９０－９５℃５－２０秒，５０－６２℃３０－６０秒，共３０－４０个循环。该试剂盒包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５所示序列中的至少一种或包含本发明专利技术中的引物对中的至少一对。与现有技术相比，本发明专利技术的高危型ＨＰＶ的荧光ＰＣＲ筛查方法及其引物、探针和试剂盒针对１４种高危型ＨＰＶ的筛查，其特异性和敏感性高，可操作性强，能同时检测１４种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群众的需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人类乳头瘤病毒(HPV)的'滞查方法，特別是针对高危型 HPV的荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒。
技术介绍
宫颈癌是女性的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，严重威胁着女 性的健康和生命。国际宫颈癌生物学研究(IBSCC) ;f几构报道，93%以上的宫 颈癌组织中可检出HPV-DNA。研究表明HPV是引起宫颈癌的主要因素，流行 病学研究显示HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。大量临床资料表明，HPV感 染是引发宫颈病变的重要原因。HPV是一类特异感染人皮肤、黏膜的非均质、双股环形DNA病毒，基因约 8kb长。根据其功能的活动时段可分为3个编码区，即早期区、晚期区和长控区。 迄今已发现120多种HPV亚型，依致病力大小，将HPV分为低危型和高危型 两种。低危型主要导致生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣、宫颈扁平湿 疣类病变和4氐度子宫颈上皮内瘤样变(CINI级)，主要亚型有HPV6、 11、 42、 43、 44等。高危型主要导致高度子宫颈上皮内瘤样变，即CINII、 III级和宫颈 癌，主要亚型有HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68 这13种亚型。现常用的HPV的检测方法如下PCR检测包括常规PCR检测、实时荧光定量PCR检测(FQ-PCR)和PCR 结合反向点杂交技术检测等。它们不仅可以对HPV感染者进行准确的早期诊断， 而且能对HPV快速分型，方法简便、灵敏度高、特异性强。4旦荧光定量PCR 检测主要针对HPV6、 11、 16和18亚型感染，其他亚型感染则会漏诊。杂交捕获DNA分析该分析是由Digene公司推出的非放射性HPV-DNA 分析系统，联合应用高效液相杂交法和敏感的化学发光信号扩增系统。现为第2 代杂交捕获法(HC II ),能检测13种高危型HPV (HR-HPV) (16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59和68)和5种低危型HPV ( LR-HPV) (6、 11、 42、 43和44)。灵敏度和特异性均较高，操作相对筒便，条件要求低，目前 已广泛应用。HCII的缺点为仅能定量不能分型。高危型HPV检测(HCII )联 合细胞学检查对于CIN I患者诊断的灵敏度、特异度分别高达100%、 97.2%, 因此临床意义重大。但两种方法联合使用价格比较贵，不适于广大普通人群筛 查。原位杂交技术使用放射性或非放射性DNA或RNA纟笨针标记细月包或组织， 能够定位，且假阳性率低。但对病毒复制较少的宫颈癌及浸润癌，其敏感性较 低，仅为40%~50%。组合把基因自动检测应用基因芯片和电传感技术对HPV进行快速分型检 测，基因芯片可对HPV多种亚型同时检测，是多种亚型感染检测的好方法，但 应进一步完善以提高其敏感性和特异性。针对宫颈癌的筛查，现在还没有一种价格便宜，灵敏度高，特异性好的适 于广大普通人群采用的方法。
技术实现思路
为了克服上述技术缺陷，本专利技术的目的之一是提供一种高危型HPV的荧光 PCR筛查方法。该方法针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时 进行第一管采用的引物如SEQIDNO: l至SEQIDNO: 6所示序列，采用的探 4十如SEQIDNO: 19所示序列；第二管采用的引物如SEQIDNO: 9至SEQIDNO: 14所示序列，釆用的 探针如SEQ ID NO: 21至SEQ ID NO: 23所示序列；第三管采用的引物如SEQ ID NO: 7、 ID NO: 8、 SEQ ID NO: 15至SEQID NO: 18所示序列，采用的探针如SEQ ID NO: 20、 SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO: 25所示序列。收集50pl样品，采用常规提取DNA的方法或试剂盒提耳又纯化核酸后，加 入20pl灭菌水或TE等。在八排管中加入20pl反应液及5^1纯化后的核酸并混匀后，再放置于荧光 定量PCR仪中反应，反应条件为90-95°Cl-5分钟，热循环为90-95。C5-20秒， 50-62°C30-60秒，共30-40个循环。优选的，所述方法的反应条件为94。C2分钟，热循环为94。C10秒，55°C35 秒，共40个循环。本专利技术的第二个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查引物，这类引 物是针对高危型HPV基因序列的，选自SEQIDNO: l至SEQ ID NO: 18所示 序列中的至少一种。本专利技术还提供了高危型HPV荧光PCR筛查引物对，针对高危型HPV基因 序列，选自以下所示序列的引物对中的至少一对SEQIDNO: l和SEQ ID NO: 2、 SEQIDNO: 2和SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5、 SEQIDNO: 5和SEQ ID NO: 6、 SEQIDNO: 7 和SEQ ID NO: 8、 SEQIDNO: 9和SEQ ID NO: 10、 SEQIDNO: 11和SEQ ID NO: 12、 SEQIDNO: 13和SEQIDNO: 14、 SEQIDNO: 15和SEQ ID NO: 16、 SEQIDNO: 17和SEQ ID NO: 18。本专利技术的第四个目的是提供高危型HPV荧光PCR筛查探针，该类探针是针 对高危型HPV基因序列，选自SEQIDNO: 19至SEQ ID NO: 25所示序列中 的至少一种。本专利技术的第五个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查试剂盒，该试 剂盒针对高危型HPV，包含SEQ ID NO: l至SEQ ID NO: 25所示序列中的至 少一种。本专利技术的第六个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查试剂盒，该试 剂盒针对高危型HPV，包含以下所示序列的引物对中的至少一对SEQIDNO:l和SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18。上述的高危型HPV包含14种亚型HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 67和68型。与现有技术相比，本专利技术的针对14种高危型HPV的荧光PCR筛查方法及 其引物、探针和试剂盒针对14种高危型HPV的筛查，其特异性和敏感性高， 可操作性强，能同时检测14种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群 众的需求。具体实施例方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应 理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例 中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。以下实施例主要是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高危型ＨＰＶ荧光ＰＣＲ筛查方法，其特征在于，针对高危型ＨＰＶ基因序列，采用多重ＰＣＲ分三管同时进行：　第一管采用的引物如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６所示序列，采用的探针如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９所示序列；　 第二管采用的引物如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４所示序列，采用的探针如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３所示序列；　第三管采用的引物如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１５至ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８所示序列，采用的探针如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５所示序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏晓波，周荣，刘文宽，
申请(专利权)人：广州锐达生物科技有限公司，呼吸疾病国家重点实验室，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]