【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种提高米卡芬净前体物质fr901379产量的方法及鞘茎点霉工程菌。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、米卡芬净前体物质fr901379属于棘白菌素类抗生素，是一种新型的环脂肽类化合物，分子式为c51h81nao21s，该类抗生素可以非竞争性抑制参与真菌细胞壁合成β-(1,3)-d-葡聚糖合酶，因其作用机制使该类抗生素具有毒副作用小的优点。目前，上市的棘白菌素类抗生素有卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净，主要用于深部真菌感染的治疗。米卡芬净生产流程较为清楚：由微生物coleophoma empetri发酵生产的前体物质fr901379通过脱酰基酶催化获得fr179624，再经化学修饰合成米卡芬净。研究表明能够合成米卡芬净前体物质的底盘菌谱较窄，鞘茎点霉coleophoma empetri是其唯一生产菌株。
2、fr901379遗传信息的缺失以及底盘菌遗传转化方法的复杂性，目前极少开展基因工程提升发酵产量的工作。目前米卡芬净主要的研究方向集中在菌种选育、发酵过程条件优化、侧链脱酰基及其高纯度制备技术。因此，开发一种可以高效合成fr901379的coleophoma sp.底盘菌具有重要应用价值。
3、目前，应用于丝状真菌的遗传转化技术包括电击转化、基于原生质体的peg/cacl2转化、基因枪转化和农杆菌介导转化等。其中，农杆菌介导的遗传转化技术，因其成本低、操作简单、转化效率高、遗传稳定等优点，得到了广泛的应用。真菌的农杆菌介导遗传转化，其作法和原理是：农杆菌是土壤中的一种革兰氏阴
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种用于产米卡芬净前体物质fr901379的鞘茎点霉工程菌及其应用，增加了fr901379合成过程中氨基酸前体的供应，提高了目标产物的发酵产量。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种提高米卡芬净前体物质fr901379产量的方法，所述方法是在鞘茎点霉基因组中过表达支链氨基酸转氨酶基因(cefe)或2-异丙基苹果酸合成酶基因(cefd)，筛选提高米卡芬净前体物质fr901379产量的鞘茎点霉工程菌，再将鞘茎点霉工程菌发酵培养，提高米卡芬净前体物质fr901379产量。
4、优选的，所述支链氨基酸转氨酶基因(cefe)核苷酸序列如seq id no.2所示；所述2-异丙基苹果酸合成酶基因(cefd)核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、优选的，所述支链氨基酸转氨酶基因(cefe)或2-异丙基苹果酸合成酶基因(cefd)均采用来源于构巢曲霉的gdpa启动子调控，所述gdpa启动子核苷酸序列如seq id no.1所示。
6、优选的，所述鞘茎点霉工程菌按如下方法构建：(1)将目的基因与启动子连接至载体pdht中，构建含目的基因的载体；(2)将含目的基因的载体转化至农杆菌；(3)将步骤(2)农杆菌与鞘茎点霉孢子液共同培养，筛选阳性转化子，获得所述的鞘茎点霉工程菌。
7、优选的，所述鞘茎点霉工程菌发酵培养的方法为：将所述鞘茎点霉工程菌接种至发酵培养基中，20-30℃、200-300rpm培养5-15d(优选25℃、240rpm培养10天)，获得含米卡芬净前体物质fr901379的发酵液；所述种子培养基组成：葡萄糖20g/l，玉米淀粉10g/l，黄豆饼粉10g/l，kh2po4 2g/l，溶剂为水，用naoh调ph值为5.5；发酵培养基组成：葡萄糖10g/l，山梨醇100g/l，黄豆饼粉18g/l，柠檬酸三铵3g/l，feso4 0.3g/l，(nh4)2so4 3g/l，mnso40.5g/l，无水mgso4 2g/l，kh2po4 1g/l，caco34g/l，溶剂为水，ph值正常。
8、优选的，所述鞘茎点霉工程菌发酵前先进行种子扩大培养，再将种子液按体积浓度5-15％(优选10％)接种量接种到发酵培养基中，所述种子液是将鞘茎点霉工程菌接种至种子培养基中，20-30℃、200-300rpm培养1-3d；所述种子培养基组成：葡萄糖20g/l，玉米淀粉10g/l，黄豆饼粉10g/l，kh2po4 2g/l，溶剂为水，ph值为5.5。
9、本专利技术还涉及一种所述方法构建的用于产米卡芬净前体物质fr901379的鞘茎点霉工程菌。所述工程菌以鞘茎点霉(coleophoma empetri)为出发菌株，优选购自biovectorntcc典型培养物保藏中心，货号coleophoma empetri f11899。
10、与现有方法相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术通过农杆菌(atm)转化的方式将支链氨基酸转氨酶基因(cefe)或2-异丙基苹果酸合成酶基因(cefd)过表达载体转入鞘茎点霉中，得到稳定生长的、基因组中插入有农杆菌t-dna的鞘茎点霉基因工程菌株。本专利技术构建的工程菌能够用于生产fr901379，产量较原始菌株提高27％。本专利技术方法具有操作简单高效，且准确率高的特点。
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1.一种提高米卡芬净前体物质FR901379产量的方法，其特征在于，所述方法是在鞘茎点霉基因组中过表达支链氨基酸转氨酶基因cefE或2-异丙基苹果酸合成酶基因cefD，筛选提高米卡芬净前体物质FR901379产量的鞘茎点霉工程菌，再将鞘茎点霉工程菌发酵培养，提高米卡芬净前体物质FR901379产量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支链氨基酸转氨酶基因cefE核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2-异丙基苹果酸合成酶基因cefD核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述支链氨基酸转氨酶基因cefE或2-异丙基苹果酸合成酶基因cefD均采用来源于构巢曲霉的gdpA启动子调控。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gdpA启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鞘茎点霉工程菌按如下方法构建：(1)将目的基因与启动子连接至载体pDHt中，构建含目的基因的载
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鞘茎点霉工程菌发酵培养的方法为：将鞘茎点霉工程菌接种至发酵培养基中，20-30℃、200-300rpm培养5-15d，获得含米卡芬净前体物质FR901379的发酵液；发酵培养基组成：葡萄糖10g/L，山梨醇100g/L，黄豆饼粉18g/L，柠檬酸三铵3g/L，FeSO4 0.3g/L，(NH4)2SO4 3g/L，MnSO4 0.5g/L，无水MgSO42g/L，KH2PO4 1g/L，CaCO3 4g/L，溶剂为水，pH值正常。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述鞘茎点霉工程菌发酵前先进行种子扩大培养，再将种子液按体积浓度5-15％接种量接种到发酵培养基中，所述种子液是将鞘茎点霉工程菌接种至种子培养基中，20-30℃、200-300rpm培养1-3d；所述种子培养基组成：葡萄糖20g/L，玉米淀粉10g/L，黄豆饼粉10g/L，KH2PO4 2g/L，溶剂为水，pH值为5.5。
9.一种权利要求1所述方法构建的用于产米卡芬净前体物质FR901379的鞘茎点霉工程菌。
...【技术特征摘要】
1.一种提高米卡芬净前体物质fr901379产量的方法，其特征在于，所述方法是在鞘茎点霉基因组中过表达支链氨基酸转氨酶基因cefe或2-异丙基苹果酸合成酶基因cefd，筛选提高米卡芬净前体物质fr901379产量的鞘茎点霉工程菌，再将鞘茎点霉工程菌发酵培养，提高米卡芬净前体物质fr901379产量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述支链氨基酸转氨酶基因cefe核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2-异丙基苹果酸合成酶基因cefd核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述支链氨基酸转氨酶基因cefe或2-异丙基苹果酸合成酶基因cefd均采用来源于构巢曲霉的gdpa启动子调控。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gdpa启动子核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述鞘茎点霉工程菌按如下方法构建：(1)将目的基因与启动子连接至载体pdht中，构建含目的基因的载体；(2)将含目的基因的载体转化至农杆菌；(3)将步骤(...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，朱文静，周海岩，鲍印琦，段晓羽，牛坤，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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