【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及弹性蛋白肽制备，尤其是涉及一种类人源弹性蛋白多肽及其制备方法和应用。
技术介绍
1、弹性蛋白是动物体内一种重要的结构蛋白，在生物体内的含量仅次于胶原蛋白，广泛存在于血管、心脏、肺、韧带、皮肤等结缔组织中，在维持组织形态、赋予组织伸缩运动、抗外力形变等功能方面发挥着不可替代的作用。另外，弹性蛋白作为一种重要的细胞外基质蛋白，与纤维组织内的细胞存在密切的相互作用，参与诱导细胞趋化、促进细胞增殖、调节细胞分化等组织稳态所必需的生理过程，具有重要的生物学功能。
2、但是，弹性蛋白在人体内的合成从出生开始逐渐升高，到青春期达到峰值后迅速下降。人体内弹性蛋白含量的迅速下降会导致具有伸缩形变功能的组织器官，例如心脏、血管、韧带、皮肤等，弹性减弱直至消失、功能减退、抗逆性差，出现衰老状态，以最直观的皮肤为例，出现弹性下降/消失、皮肤松垂、有细纹、毛孔增大、对病菌等的攻击耐受力下降、伤口愈合慢等。
3、食用猪蹄等食物可以部分弹性蛋白，但是不是所有个体都喜食用如猪蹄等食物，且猪蹄等食物中还含有大量的脂肪，不宜长期大量食用。“鲣鱼弹性蛋白肽”是我国卫健委目前唯一批准使用的可食用弹性蛋白原料，但是一条大大的鲣鱼只有一个很小的心脏动脉球，且从鲣鱼心脏动脉球中提取的弹性蛋白量很少，这就导致能进入市场的鲣鱼弹性蛋白很少，成本高产品价格昂贵。
4、dna重组技术使体外表达目的蛋白成为可能，以大肠杆菌为代表的原核表达系统具有遗传背景清晰、生长速度快、表达量高、易于操作等优点，在科研、生物医药等领域已经得到广泛应用
5、但真核蛋白在原核宿主细胞中的表达常会遇到一些问题，例如：密码子偏好导致一些稀有密码子多的蛋白在原核宿主中不表达；外源蛋白在宿主细胞中容易被水解；外源蛋白以无生物活性不可溶的包涵体形式存在等。研究表明，外源蛋白在原核宿主细胞中以包涵体形式存在的主要原因是：(1)外源蛋白在宿主细胞中的大量快速合成使宿主细胞质变得十分拥挤，促进蛋白聚集形成包涵体；(2)原核宿主细胞质低的氧化还原电势影响了对蛋白质的折叠有很大影响的二硫键的形成；(3)有限的折叠酶和分子伴侣不能满足大量表达的外源蛋白折叠所需。
6、人体内的弹性蛋白基因相较于其他哺乳动物，同源程度接近80％，氨基酸组成有差异但未达到显著水平，有研究表明，对弹性蛋白序列进行编码显示，人的弹性蛋白比哺乳动物的弹性蛋白少2个外显子，人的弹性蛋白序列内不存在外显子26a所对应的蛋白序列片段，其他动物体内普遍存在的34、35结构域，在人弹性蛋白中是缺失的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种类人源弹性蛋白多肽及其制备方法和应用，以解决动物源提取的弹性蛋白肽产量低、价格昂贵，提取的弹性蛋白肽存在免疫原和病毒风险，与人弹性蛋白组成有差异，透皮能力差，作用效果不明显；应用原核表达方法制备的弹性蛋白表达不稳定、溶解性差的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供一种类人源弹性蛋白多肽及其制备方法和应用。
3、一种类人源弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(gpvgvk)n，n＝2-5。
4、优选的，所述类人源弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(gpvgvk)3。
5、一种如上所述的类人源弹性蛋白多肽的制备方法，步骤如下：
6、s1、合成编码所述类人源弹性蛋白多肽的基因序列，然后将基因序列插入质粒中形成重组质粒，将重组质粒转入dh5α大肠杆菌中进行繁殖；
7、s2、平板培养基倒置培养过夜，挑取多个单菌落测序；
8、s3、选测序正确的菌落摇菌、提取重组质粒，然后将重组质粒转染到bl21感受态细胞中，待菌液长到一定od值时诱导表达；
9、s4、提取可溶性蛋白溶液，对蛋白进行纯化即得到类人源弹性蛋白多肽。
10、优选的，所述步骤s1中的质粒为pet32；步骤s2中大肠杆菌涂板后置于37℃，5％co2条件下培养1晚上；步骤s2和s4中的一定od值均为0.5-0.7。
11、优选的，所述步骤s3中的摇菌为摇菌过夜或摇菌至od600为0.6，s2和s4中的一定od值均为0.6。
12、优选的，所述步骤s3中转染到bl21感受态细胞后将bl21加入含有50μg/ml氨苄青霉素lb液体培养基中，于37℃震荡培养，当达到od值时于超净台上加入iptg，再震荡培养3-5h，iptg的加入量为0.04mm/l。
13、优选的，所述步骤s4中提取可溶性蛋白溶液的方法为：将菌液于6000-8000rpm、4℃条件下离心5-10min，留1/3体积的上清液，吸打混匀，破碎菌体，于10000-12000rpm、4℃条件下离心10-15min，收集全部上清液于新的离心管中再重复上述离心步骤，直至无可见沉淀物，即为含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液。
14、优选的，所述步骤s4中蛋白的纯化方法为亲和层析、离子交换层析和凝胶层析中的一种。
15、优选的，破碎菌体的方式为超声破碎、均质破碎、球磨破碎中的一种或几种。
16、一种如上所述的类人源弹性蛋白多肽在保健食品和护肤品中的应用。
17、因此，本专利技术提供的一种类人源弹性蛋白多肽及其制备方法和应用，具有以下技术效果：
18、1.本专利技术以人源全长弹性蛋白作为序列设计的主要参考来源，获得的弹性蛋白与人体的弹性蛋白同源性高、组成差异更小，亲和度和相容性更高，更适于人体胶原蛋白的补充；
19、2.本专利技术提供的类人源弹性蛋白多肽序列短、大肠杆菌摇菌时间短、折叠酶的量足够、所用的bl21菌株缺失内源性的蛋白酶等多种有利参数组合使应用本专利技术提供的原核表达方法可以成功表达人源弹性蛋白多肽，并且制备的弹性蛋白多肽不是以包涵体形式存在，水溶性好，弹性蛋白产量高、纯度好、质量可控、免疫原性低和无病毒传播风险；
20、3.本专利技术利用基因工程的方法制备弹性蛋白成本低廉，可以大规模生产，制备的弹性蛋白分子量小、透皮能力强，可以进入浅表真皮组织发挥其生物学作用，进而使更多的消费者受益。
21、下面通过实施例，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。
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1.一种类人源弹性蛋白多肽，其特征在于：所述类人源弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(GPVGVK)n，n＝2-5。
2.根据权利要求1所述的一种类人源弹性蛋白多肽，其特征在于：所述类人源弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(GPVGVK)3。
3.一种如权利要求1所述的类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的质粒为PET32；步骤S2中大肠杆菌涂板后置于37℃，5％CO2条件下培养1晚上；步骤S2和S4中的一定OD值均为0.5-0.7。
5.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的摇菌为摇菌过夜或摇菌至OD600为0.6，步骤S2和S4中的一定OD值均为0.6。
6.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中转染到BL21感受态细胞后将BL21加入含有50μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，于37℃震荡培养，当达到OD值时于超净台上加入IPTG，再震荡培养3
7.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中提取可溶性蛋白溶液的方法为：将菌液于6000-8000rpm、4℃条件下离心5-10min，留1/3体积的上清液，吸打混匀，破碎菌体，于10000-12000rpm、4℃条件下离心10-15min，收集全部上清液于新的离心管中再重复上述离心步骤，直至无可见沉淀物，即为含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液。
8.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中蛋白的纯化方法为亲和层析、离子交换层析和凝胶层析中的一种。
9.根据权利要求7所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于：破碎菌体的方式为超声破碎、均质破碎、球磨破碎中的一种或几种。
10.一种如权利要求1-2任一项所述的类人源弹性蛋白多肽在保健食品和护肤品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种类人源弹性蛋白多肽，其特征在于：所述类人源弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(gpvgvk)n，n＝2-5。
2.根据权利要求1所述的一种类人源弹性蛋白多肽，其特征在于：所述类人源弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(gpvgvk)3。
3.一种如权利要求1所述的类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：
4.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中的质粒为pet32；步骤s2中大肠杆菌涂板后置于37℃，5％co2条件下培养1晚上；步骤s2和s4中的一定od值均为0.5-0.7。
5.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中的摇菌为摇菌过夜或摇菌至od600为0.6，步骤s2和s4中的一定od值均为0.6。
6.根据权利要求3所述的一种类人源弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤s3中转染到bl21感受态细胞后将bl21加入含有50μg/ml氨苄青霉素lb液体...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵子方，郭红星，刘赛赛，李立，周尽学，
申请(专利权)人：海南华研胶原科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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