【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于rna加帽，尤其涉及一种rna加帽方法及其应用。
技术介绍
1、目前，rna加帽的方法主要包括酶法加帽和共转录加帽两种。酶法加帽使用加帽酶进行转录后加帽，最常使用的是牛痘病毒加帽酶(vce)，该反应过程中加帽酶的异源二聚体会导致产量较低，短期内难以放大。酶法加帽由于增加质控项目，导致工序繁杂，虽然酶法加帽的加帽率100％，但成本较高，不利于工业生产。共转录加帽使用帽类似物进行共转录加帽，目前常用的帽类似物有两种：arca(抗-反帽结构类似物)和cap 1帽类似物。共转录加帽为一步法加帽，操作简单，使用cap 1结构帽类似物，加帽率可达95％。但研究发现帽类似物会以相反的方向结合mrna链，反向加帽的mrna不能被核糖体识别，导致翻译效率降低，为了避免反向加帽，mrna疫苗开发过程中一般采用具有甲基化修饰的修饰帽类似物来进行共转录加帽，但这会导致加帽过程变得繁琐。
2、tata box(也称为tata序列)是一种dna序列，通常位于基因启动子区域的位置，它是多种真核生物dna转录的起始点。这个序列中的"ata"部分被rna聚合酶ii所搜寻，因此rna聚合酶ii就能够固定在基因的启动子区域，开始转录rna。这个序列是一个吸引rna聚合酶ii的转录因子tbp(tata结合蛋白)的结合位点。tbp与其他转录因子一起形成一个复合物，它们共同辅助rna聚合酶ii开始转录，使其正常地从基因的启动子区域开始从dna序列合成rna链。综上所述，tata box有潜力成为一种新的加帽原料。然而，由于加帽效率、完整性等问题，
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种全新的加帽方法，不仅可以实现在rna合成时即完成加帽操作，而且可以提高加帽效率，相比于现有的加帽产品也更加稳定，加帽率达到95％以上。同时，传统的rna帽类似物加帽方法步骤长、成本高、需要更多的设备投资，本专利技术与传统加帽方法比较，可以简化步骤、降低成本，提高合成rna的效率，并具有较高的生物活性。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种rna加帽方法，包括以下步骤：
3、s1、将编码目标rna的dna序列连接至seq id no.1或seq id no.2所示的序列之后，将所得序列插入自复制mrna载体上，构建得到重组载体；
4、s2、将s1所得重组载体导入宿主细胞中，表达出加帽完成的目标rna。
5、进一步地，编码目标rna的dna序列包含5’utr、开放阅读框、3’utr和poly a尾。
6、进一步地，序列seq id no.1-2均为“t7启动子+加帽结构”，通过序列taatacgactcactataggg改造而来。本专利技术通过删去tata box后的第一个和第二个碱基g，得到一种新的加帽结构taatacgactcactatag，以tata之后的g为转录起始位点，在目标rna的5’端添加cap1类帽子，如gau、gag等。序列seq id no.1-2的具体序列如下：
7、taatacgactcactata gat；
8、taatacgactcactata gag。
9、进一步地，所述自复制mrna载体中含有结构蛋白(nsp1～nsp4)，结构蛋白序列可来源于含正链rna的病毒，本领域技术人员可常规选择自复制mrna载体的来源，如委内瑞拉脑炎病毒(veev)、辛德毕斯病毒(sin)或者塞姆利基森林病毒(sfv)等。
10、进一步地，目标rna可为mrna等。
11、进一步地，所述目标rna加帽完成后的帽子类似物为gau或gag。
12、进一步地，在步骤s2中，表达加帽目标rna包括以下步骤：从重组菌中提取质粒dna，选择测序正确的序列加入rna体外合成体系中，转录出加帽后的rna。
13、进一步地，rna体外合成体系为含有t7 rna聚合酶、无机焦磷酸酶(用于催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐，能够使rna合成反应不可逆，从而保持rna产量)、rna酶抑制剂(保护rna不被降解)、核苷三磷酸的缓冲体系。
14、本专利技术的第二个目的是提供一种用于rna加帽的产品(如可为任意生物制品)，所述产品中包括含有seq id no.1或seq id no.2所示序列的自复制mrna载体。
15、本专利技术的第三个目的是提供上述用于rna加帽的产品在制备含有rna的生物制品中的应用。
16、本专利技术的第四个目的是提供一种含有上述rna加帽产品的宿主细胞(如大肠杆菌)或任意需要rna加帽的表达系统。以上系统可用于制备rna药物、rna递送工具等。
17、本专利技术的有益效果：
18、相比于传统的rna加帽技术，即使采用成本更低的共转录加帽技术，其操作也仍然较为繁琐，本专利技术采用了一种全新的自复制载体进行rna加帽，这使得rna在合成时即完成了加帽操作，虽然与共转录加帽技术类似，但本专利技术提供的rna加帽操作步骤少于共转录加帽技术，操作更便捷和便于后期工艺放大，并实现成本降低效果。
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1.一种RNA加帽方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的RNA加帽方法，其特征在于，所述自复制mRNA载体中含有结构蛋白，结构蛋白序列来源于含正链RNA的病毒。
3.根据权利要求1所述的RNA加帽方法，其特征在于，所述目标RNA加帽完成后的帽子类似物为GAU或GAG。
4.根据权利要求1所述的RNA加帽方法，其特征在于，在步骤S2中，表达加帽目标RNA包括以下步骤：从重组菌中提取质粒DNA，选择测序正确的序列加入RNA体外合成体系中，转录出加帽后的RNA。
5.根据权利要求4所述的RNA加帽方法，其特征在于，RNA体外合成体系为含有T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶、RNA酶抑制剂和核苷三磷酸的缓冲体系。
6.根据权利要求1所述的RNA加帽方法，其特征在于，所述自复制载体的构建方法为：
7.根据权利要求6所述的RNA加帽方法，其特征在于，步骤(1)中，反向扩增的引物如SEQID NO.3-4所示。
8.一种用于RNA加帽的产品，其特征在于，所述产品中包括含有SEQ ID NO.1
9.权利要求8所述的产品在制备含有RNA的生物制品中的应用。
10.含有权利要求8所述产品的表达系统。
...【技术特征摘要】
1.一种rna加帽方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的rna加帽方法，其特征在于，所述自复制mrna载体中含有结构蛋白，结构蛋白序列来源于含正链rna的病毒。
3.根据权利要求1所述的rna加帽方法，其特征在于，所述目标rna加帽完成后的帽子类似物为gau或gag。
4.根据权利要求1所述的rna加帽方法，其特征在于，在步骤s2中，表达加帽目标rna包括以下步骤：从重组菌中提取质粒dna，选择测序正确的序列加入rna体外合成体系中，转录出加帽后的rna。
5.根据权利要求4所述的rna加帽方法，其特征在于，rna...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊长云，周芮，
申请(专利权)人：宁波君健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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