一种用于自复制mRNA生产的工程菌制造技术

本发明专利技术提供一种用于自复制mRNA生产的工程菌，该工程菌由如下方法构建获得：选择感受态细胞作为宿主细胞E.coli Stable，E.coli Stbl3，E.coli DH5α；用热激法将质粒转入至大肠杆菌感受态细胞Stable、Stbl3、DH5α；将转化后的菌液均匀涂布在有卡那霉素的LB固体培养基上，挑选出单菌落；采用平板计数法进行活率测定。该工程菌宿主细胞的选择上，选择大肠杆菌(E.coli)系作为宿主细胞，使得细胞更容易培养，高密度发酵成本更低，挑选优选克隆E.coli Stbl3‑11和E.coli Stbl3‑18进行3L体积质粒发酵，获得了E.coli Stbl3‑18自复制mRNA工程菌，实现了该工程菌用于自复制mRNA质粒高稳定性，高质粒产量目的，为自复制mRNA制造奠定了很好的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物，具体为一种用于自复制mrna生产的工程菌。

技术介绍

1、自复制mrna是一种特殊类型的mrna，具有自我复制的能力。与传统的非自复制mrna相比，自复制mrna包含了额外复制酶相关序列，使其能够在细胞内进行自我复制，从而在应用环境中产生更多的mrna分子，表达更多更持久的目标蛋白分子。然而，增加复制酶相关序列导致质粒模版的分子更大，使得上游质粒制造增加了更多的困难。

2、自复制质粒的制造是整个工艺的起始点，对自复制mrna制造起到关键性的作用。如何保证自复制质粒的稳定性，尤其是在大分子质粒中ploya不断裂丢失，质粒放大生产过程中单位体积获得更高质粒产量，增加效率，都是自复制mrna生产所需要克服解决的问题。

3、在自复制mrna的制造中，质粒构建完成，需要转入至感受态，以便通过发酵培养工程菌获得足够数量的质粒。但是现有技术中的工程菌复制和放大过程会面临一些问题，如内部质粒稳定性、副产物形成、毒性效应等，这些问题容易导致最终的质粒产量下降或质量不佳。因此，质粒转化的宿主细胞类型选择，挑选转化后的高产量，高稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于自复制mRNA生产的工程菌，其特征在于：该工程菌由如下方法构建获得：

2.根据权利要求1所述的一种用于自复制mRNA生产的工程菌，其特征在于，所述热激法包括：将感受态细胞首先冰浴30min，然后放置在42℃金属浴上进行热激60S，再冰浴2-5min。

3.根据权利要求2所述的一种用于自复制mRNA生产的工程菌，其特征在于，所述活率测定过程中，将待测的大肠杆菌样品进行适当稀释后，均匀涂布在含有适当培养基的琼脂平板上，然后在恒定的温度下孵育；挑选优势单克隆。

4.根据权利要求3所述的一种用于自复制mRNA生产的工程菌，其特征在于：预培养的温度范...

【技术特征摘要】

1.一种用于自复制mrna生产的工程菌，其特征在于：该工程菌由如下方法构建获得：

2.根据权利要求1所述的一种用于自复制mrna生产的工程菌，其特征在于，所述热激法包括：将感受态细胞首先冰浴30min，然后放置在42℃金属浴上进行热激60s，再冰浴2-5min。

3.根据权利要求2所述的一种用于自复制mrna生产的工程菌，其特征在于，所述活率测定过程中，将待测的大肠杆菌样品进行适当稀释后，均匀涂布在含有适当培养基的琼脂平板上，然后在恒定的温度下孵育；挑选优势单克隆。

4.根据权利要求3所述的一种用于自复制mrna生产的工程菌，其特征在于：预培养的温度范围是28℃～37℃，ph值高于6.54，且该参数在发酵过程关联酸碱泵自动进行控制，所述搅拌条件为：初始值100rpm～500rpm，该搅拌参数根据溶氧量联动。

5.根据权利要求1所述的一种用于自复制mrna生产的工程菌，其特征在于：所述s8步骤进行培养后，将优选菌种进行上罐，确认大规模工艺生产的可执行性，上罐发酵通过调整参数和培养基找到适合自复制大肠杆菌生长的培养体系。

6.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊长云，李智，杨勇军，王友如，王超，徐瑶，
申请(专利权)人：宁波君健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：