生物芯片基底和制造生物芯片基底的方法技术

本发明专利技术涉及一种生物芯片基底和制造生物芯片基底的方法，该方法包括：在布置在第一层上的第二层中形成凹槽；以及在所述第二层中形成多个孔，所述多个孔抵达所述第一层，其中，所述第一层在所述多个孔的每个孔底部被暴露出来并且所述第一层所述多个孔的每个孔底部被羟基化，所述凹槽被配置以连接所述多个孔，所述凹槽的深度浅于所述多个孔的每个孔深度，所述孔和所述沟槽覆盖有盖板，以及所述被暴露的第一层被生物分子所修饰。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物芯片基底(substrate)，更具体地，用于制备将生物材料固定在基 底上预定位置的生物芯片以及用于获得关于待检测的各种生物样品的信息的基底。本专利技术 特别涉及适合于通过直接在基底上化学合成探针DNA来制备DNA芯片的生物芯片基底。
技术介绍
“生物芯片”是以下装置的通称，在所述装置中，与待检测的生物物质以特异性方 式进行化学反应的生物物质被固定在芯片表面上的预定位置。DNA芯片是生物芯片的典型例子，它用于检测包含在血液或者细胞提取物中的靶 DNA的类型和数量。DNA芯片具有例如以下结构，在所述结构中，数万种探针DNA在基底如载玻片上排 成阵列，每个探针DNA都为已知序列的单链DNA。当含有荧光标记的靶DNA的待检测液体补给到DNA芯片时，只有具有与探针DNA 序列互补的序列的靶DNA被固定，探针DNA与其形成氢键并形成双链。其结果是，靶DNA所 固定的部分是荧光显色的。通过测试在芯片上荧光显色部分的位置和颜色强度，可以检测 到靶DNA的类型和数量。为了制备以该方式使用的DNA芯片，必须将多个类型的具有预定序列的探针DNA 固定在基底表面上的预定位置。有两种主要的固定探针DNA的方法。第一种方法称为“微阵列方法”，在该方法中， 化学合成的或者由预期的活有机体中预先提取的探针DNA通过点滴或者印刷以阵列固定 在基底上。在另一种方法中，使用四个碱基胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤 (G)，在基底上直接化学合成多个类型的探针DNA，每个所述探针DNA都为具有根据设计的 预定序列的单链DNA。在第二种固定方法中，要求反应区和非反应区在用于化学合成的基底的表面上应 该以明确不同的方式形成，在所述反应区发生合成预期探针DNA的反应，所述非反应区不 涉及合成反应。作为由第二种方法制备的DNA芯片，例如“基因芯片(Gene Chip) ”(由Affymetrix Inc.生产的产品名字)是已知的。就该芯片来说，石英用作基底材料，应用显微光蚀刻(photolithography)以不同 的方式形成反应区和非反应区。而且，当化学合成探针DNA时，通过应用紫外线来活化在反 应区内的单链DNA，逐单元地形成单链DNA。在该芯片上，包含大约200，000个每个约20平方微米的点的反应区形成在单个基底上，约2，000, 000条的相同类型探针DNA的链都固定在一个点。在该芯片内，点以高密度形成于芯片上。因此，在一次测试中可以检测到大量类型 的靶DNA。日文公布的PCT申请No.平成9-500568的图2A所示的是如下所述的阵列平板 (array plate)0阵列平板制备如下首先，使Si基底的表面与氟代硅烷反应，在其上形成疏水的 氟代烷基硅氧烷薄层。然后，该薄层在规定的二维图案内移除，所以Si基底的表面在薄膜 被移除的点处将会暴露。最后，将暴露的表面与羟基硅烷或者烷基硅烷反应，所以暴露的表 面将含有羟基。因此，在该阵列平板上，Si基底的表面包含具有大表面张力的疏水性薄膜的位点 和具有亲水性羟基的位点。对于生物物质，前者用作非反应区，而后者用作反应区。当使用该阵列平板时，合成反应发生在亲水性位点，然后，待检测的液体补给到这 些位点。由于在亲水性位点周围的疏水薄膜的大的表面张力，待检测的液体保存在亲水性 位点。然而，在该阵列平板上，反应区和非反应区形成于Si基底的表面，相互之间几乎 齐平。所以，它在保存所补给的待检测液体方面没有足够的稳定性，因此，它不容易使用。而且，反应区的形成和非反应区的形成都依赖于Si表面和其它的化学品之间的 化学反应。反应并不总是以100%的产率发生，因此，反应区和非反应区之间的界限模糊不 是不可能。另一问题是疏水性薄膜和亲水性位点容易受外界的破坏。从保存待检测的液体方面考虑，在基底上，具有能够保存待检测液体的结构的底 孔(bottomed well)分布在基底的表面上，所述基底对于具有上述结构的阵列平板是优选。作为该类型的基底，日文公布的PCT申请No. 2002-537869公开了用于直接合成探 针DNA的基底和使用它化学合成探针DNA的方法。该基底的简图如附图说明图1所示。基底1由Si晶片制成。在基底1的表面上，多个微管2形成在预定的阵列上。微 管2是凹陷的孔(底孔)，其直径为约1 μ m到1000 μ m,孔深为约1 μ m到500 μ m,它用作用 于探针DNA的化学合成的反应区。除了这些孔之外的表面部分是非反应区。该基底A制备如下步骤ai 通过应用显微光蚀刻和腐蚀于Si晶片1的表面Ia，形成如图2所示的中 间体A1,在该中间体上，与待形成的底孔几乎相同形状的凹陷孔2A形成在底孔即将形成的 位置上。步骤a2 通过例如在中间体A1上的Si晶片表面1和凹陷孔2A表面(它们的底部 和侧面)上进行热氧化处理，形成如图3所示的中间体A2，在该中体中，仅有这些表面的表 层部分转变成厚度约0. 5 μ m的氧化硅层3。步骤a3 在中间体^的氧化硅层3的表面上进行硅烷化处理。具体地，通过应用 使用NaOH的Brown方法，氧化硅层3的表面用碱处理，然后，用例如具有环氧硅烷类基团的 活性硅烷化剂处理。然后，硅烷化剂和环氧树脂的水解之间的联系成功地建立起来。作为 结果，得到如图4所示的中间体A3，在该中间体中，硅烷层4形成在氧化硅层3的表面上。在中间体A3中，由于硅烷的羟基存在于其整个表面，整个表面可以与DNA亚磷酰 胺反应。步骤a4 通过应用亚磷酰胺方法于中间体A3的表面，用DNA亚磷酰胺T (胸腺嘧 啶)合成链长相应于约5个碱基的单链DNA的链。因此，形成具有如图5所示的底孔的中 间体A4，在该中间体中，寡核苷酸(5T)间隔层形成在硅烷层4上。应注意的是，合成的寡核苷酸(5T)的末端用二甲氧基三苯甲基(DMT)来阻断。中间体A4的整个表面覆盖有用DMT阻断的寡核苷酸(5T)的间隔层。然而，当通过 消除DMT阻断末端(脱除三苯甲基)来激活寡核苷酸的末端时，在那里可以合成探针DNA。因此，就中间体^来说，当制备DNA芯片时，由寡核苷酸(5T)的间隔层5所形成 的整个表面用作反应区。然而，这不能满足用于合成探针DNA的基底的条件，即如下条件底孔和其它部分 应该明确分开地分别用作反应区和非反应区。因此，在中间体A4的层5上需要进行处理，使底孔成为反应区，而使其它部分变成 非反应区。该处理就是下一步骤的加帽处理。步骤a5 如图6所示，在中间体A4上，仅仅底孔充满有树脂滴(resindroplet) 6。 在这种情形下，在层5上进行加帽。具体地，通过在寡核苷酸(5T)的间隔层5上脱除三苯甲基处理，寡核苷酸(5T)的 末端被激活。然后，使用三氯乙酸、乙酸酐、二甲氨基吡啶等，被激活的寡核苷酸(5T)的末 端被阻断和失活。然后，使用有机溶剂如四氢呋喃，填满底孔的树脂滴6溶解并且去除，所以层5在 底部孔处将会暴露。在加帽过程中，由于底孔填满有树脂，在底孔内的寡核苷酸(5T)的间隔层5并没 有被加帽，而保持在能够反应的状态。同时，在除了被加帽的底孔以外的部分上，寡核苷酸 (5T)的间隔层变成不能进行合成反应的状态。这样，可以制备用于合成探针DNA的、如图7所示截面结构的基底。在该基底A上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备生物芯片基底的方法，其包括：在布置在第一层上的第二层中形成凹槽，以及在所述第二层中形成多个孔，所述多个孔抵达所述第一层，其中，所述第一层在所述多个孔的每个孔底部被暴露出来并且所述第一层所述多个孔的每个孔底部被羟基化，其中，所述凹槽被配置以连接所述多个孔，其中，所述凹槽的深度浅于所述多个孔的每个孔深度，其中，所述孔和所述凹槽覆盖有盖板，以及其中，所述被暴露的第一层被生物分子所修饰。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：五所尾康博，黑岩孝朗，石川尚弘，小原大辅，山崎信介，弗朗索瓦斯维内，
申请(专利权)人：株式会社山武，
类型：发明
国别省市：JP[日本]