【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种固定化酶及利用该固定化酶制备d-阿洛糖的方法。
技术介绍
1、d-阿洛糖是一种己醛糖，是一种罕见的单糖，为白色无味的结晶固体，是无热量的糖，没有毒性。化学式ch2oh(choh)4cho，分离于一种非洲灌木的叶子，但是提取率极低，所以d-阿洛糖的人工合成变得更为迫切。d-阿洛糖溶于水但几乎不溶于甲醇，d-阿洛糖是葡萄糖的c-3差向异构体。d-阿洛糖主要以环状形式存在，由β-d-allo-1.5-吡喃糖(77.5％)，α-d-allo-1.5-吡喃糖(14％)，β-d-allo-1.4-呋喃糖(5％)和α-d-allo-1.4-呋喃糖(3.5％)组成，其中β-d-allo-1.5-吡喃糖是主要成分。
2、近年来，由于d-阿洛糖具有许多药物活性而引起了广泛关注，d-阿洛糖抑制癌变，特别是在氧化应激条件下，可以抑制多种癌细胞系的增殖，包括宫颈癌、肝细胞癌、卵巢、头颈部、皮肤和前列腺癌。并且在癌症治疗中d-阿洛糖和放射的组合提高了肿瘤的治愈率。d-阿洛糖还可以作为一种抗氧化剂，在作为药物制剂中的治疗剂和配方食品中的功能性成分有一定的潜力。d-阿洛糖作为一种抗炎剂，可抑制缺血-再灌注损伤，抑制节段性中性粒细胞生成，并降低血小板计数。d-阿洛糖与低剂量fk506联合使用显著增加了同种异体移植物的存活率，同时减少了组织损伤。此外，右旋糖酐对细胞有冷冻保护作用。因此，d-阿洛糖在外科手术和移植中有一定的应用前景。
3、然而，d-阿洛糖的来源主要来源于化学合成和生物合成，由于化学合成有很多弊
4、目前对d-阿洛糖的研究主要是围绕生产d-阿洛糖的工程菌及其构建方法和应用开展等方面进行研究的，该d-阿洛糖体外酶合成路线可以以葡萄糖、果糖及阿洛酮糖为原料，通过酶催化反应合成d-阿洛糖。但是，该合成新路线不仅酶分子需要经过繁琐的提取和纯化才能用于催化反应，导致酶的生产成本高昂；而且生物酶是一种水溶性分子，在催化反应结束后水溶性酶分子难以回收再利用，造成酶的浪费。这些因素导致d-阿洛糖合成新路径的生产成本高昂，亟需开发一种酶固定化方法，固定化d-阿洛糖合成新路径中的酶，使其能够重复利用，降低生产成本。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的第一个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种固定化酶的制备方法，得到的固定化酶能够重复利用，生产成本低。
2、为解决上述第一个技术问题，本专利技术的技术方案是：
3、一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：
4、a：将表达l-鼠李糖异构酶的大肠杆菌工程菌以2-5％v/v的接种量接种于种子培养基中，于30-40℃的条件下培养8-10h，得培养液；
5、培养液以2-5％v/v的接种量接种于发酵培养基中培养30-40h，得到发酵液；
6、b：将发酵液经均质机进行破碎，得到破碎液，向破碎液中加入占其体积3-5‰v/v的磷酸氢二钠和1-5‰v/v的氯化钙，并用氢氧化钠调ph至6.0-7.0，后加入占破碎液体积的1-5％g/l的硅藻土，然后经板框过滤，得到粗酶液；
7、c：将粗酶液进中空纤维膜，浓缩5-10倍，得到浓缩粗酶液；
8、d：将浓缩粗酶液加入0.01-0.05％v/v的戊二醛溶液，在20-50℃的条件下交联0.5-1.5h，然后用ph为7.0的磷酸盐缓冲液和纯化水分别洗涤3次，得到交联酶液；
9、e：将7-9％wt的聚乙烯醇和2-4％wt的海藻酸钠按体积比1：1～1.5混匀，得到混合液，将交联酶液和混合液按照体积比1：2～4的比例混匀并滴加至1.8-5.8％wt氯化钙的硼酸饱和溶液中，在2-10℃的条件下静置10-15h，然后过滤，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，再用纯化水洗涤3次，得固定化酶。
10、优选的，所述表达l-鼠李糖异构酶的大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌bl21,分泌表达载体质粒为pet-28a，目的基因的基因序列为seq id no:1所示，具体为：gtgaataaacacaaaaagatcccattacgcaaatgtgtagtgactggtgaaatgaagccta aaaaggaactgatccgagttgtacggtcgaaagaaggcgaaatctcagtagacccgaccggaaaaaagaatgggcggggtgcttatttaacgctggataaagagtgcatcttagcagcaaaaaagaaaaacactttgcaaaatcaatttcaatcacaaatcgatgaccagattttcgatgaattgctggaactggcggaaaaggtgaaaaaataa。
11、优选的，步骤a中的发酵条件为：温度为34-40℃，风速1.0-2.0m3/h，转速200-300rpm，压力0.1-0.3mpa，用氨水调节ph至7.0±0.1，溶氧为20-30％。
12、优选的，步骤b中均质机的参数为压力为40-45mpa，循环次数2-5次，温度控制在30℃以下。
13、步骤c中空纤维膜的孔径范围为50000-100000da。
14、步骤c中的浓缩粗酶液加入重力纯化柱中，用0.1-0.5mol/l含咪唑的磷酸盐缓冲盐进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液加入步骤d的戊二醛溶液中进行交联反应。
15、步骤e中交联酶液和混合液滴加前先用碳酸钠溶液将含氯化钙的硼酸饱和溶液的ph调至6.0-7.0。
16、本专利技术所要解决的第二个技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种固定化酶制备d-阿洛糖的方法，固定化酶能够重复利用，生产成本低。
17、为解决上述第二个技术问题，本专利技术的技术方案是：
18、一种固定化酶制备d-阿洛糖的方法，包括以下步骤：
19、f：用ph为7的磷酸盐缓冲溶液配制浓度为50-100g/l的d-阿洛酮糖缓冲溶液，然后加入权利要求1中的固定化酶，搅拌；
20、g：不断加入0.1-0.5mol/l的tris-hcl缓冲液维持反应体系的ph 6.0-9.0，在60-80℃的条件下进行酶的催化反应，得d-阿洛糖。
21、步骤f中固定化酶的加入量占d-阿洛酮糖溶液体积的3-10％g/ml。
22、由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
23、1.本专利技术的固定化条件温和，且酶的固定化率高。
24、2.本专利技术的固定化酶具有优异的催化活性和良好的稳定性，固定化酶用于阿洛糖生产，过程简便，经过简单的处理可循环利用，大大降低了多次阿洛糖制备所需投入酶的用量，降低生产成本。
25、3.本专利技术的固定化酶为颗粒状，具有不易泄露、稳定性好的优点，而且底物和产物的传递受到的阻遏作用较小，有助于固定化酶对本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：所述表达L-鼠李糖异构酶的大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21,分泌表达载体质粒为pET-28a，目的基因的基因序列为SEQ ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤A中的发酵条件为：温度为34-40℃，风速1.0-2.0m3/h，转速200-300rpm，压力0.1-0.3Mpa，用氨水调节pH至7.0±0.1，溶氧为20-30％。
4.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤B中均质机的参数为压力为40-45Mpa，循环次数2-5次，温度控制在30℃以下。
5.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤C中空纤维膜的孔径范围为50000-100000Da。
6.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤C中的浓缩粗酶液加入重力纯化柱中，用0.1-0.5mol/L含咪唑的磷酸盐缓冲盐进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液
7.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤E中交联酶液和混合液滴加前先用碳酸钠溶液将含氯化钙的硼酸饱和溶液的pH调至6.0-7.0。
8.一种固定化酶制备D-阿洛糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的一种固定化酶制备D-阿洛糖的方法，其特征在于：步骤F中固定化酶的加入量占D-阿洛酮糖缓冲溶液体积的3-10％g/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：所述表达l-鼠李糖异构酶的大肠杆菌工程菌的宿主菌为大肠杆菌bl21,分泌表达载体质粒为pet-28a，目的基因的基因序列为seq id no:1所示。
3.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于，步骤a中的发酵条件为：温度为34-40℃，风速1.0-2.0m3/h，转速200-300rpm，压力0.1-0.3mpa，用氨水调节ph至7.0±0.1，溶氧为20-30％。
4.如权利要求1所述的一种固定化酶的制备方法，其特征在于：步骤b中均质机的参数为压力为40-45mpa，循环次数2-5次，温度控制在30℃以下。
5.如权利要求1所述的一...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱理平，徐良平，邱崇顺，淮建路，
申请(专利权)人：东台市浩瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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