【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及用于检测甲基胞嘧啶的方法。序列表本申请包含序列表，该序列表已以ascii格式电子提交并且据此全文以引用方式并入。所述ascii副本创建于2022年6月27日，命名为ip-2068-pct_sl，并且大小为8,793字节。
技术介绍
1、在如人类的活生物体内，基因组中所选择的胞嘧啶(c)可变得甲基化。举例来说，已知s-腺苷-l-甲硫氨酸(sam)为由称为甲基转移酶(mtase，mt酶)的酶催化的多种生物甲基化反应的普遍甲基供体。酶5-mt酶可以如deen等人，《甲基转移酶引导的生物分子标记和其应用(methyltransferase-directed labeling of biomolecules and itsapplications)》，《应用化学国际版(angewandte chemie international edition)》56:5182-5200(2017)所描述的方式将甲基基团添加到胞嘧啶的位置5以形成5-甲基胞嘧啶(5mc)，该文献的全部内容以引用的方式并入本文中。其他酶可以氧化胞嘧啶的甲基基团以形成5mc衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)，并且可以进一步氧化5hmc以形成5mc衍生物5-甲酰基胞嘧啶(5fc)和5-羧基胞嘧啶(5cac)。
2、5mc和5hmc可以称为表观遗传标记物，并且可能需要在基因组序列中检测它们。例如，5mc被认为在基因表达的调节、亲代印记和包括癌症在内的人类疾病的分子病因学中具有不同的作用。已经发现了用于癌症和其他疾病的数百种甲基化生物标志物，并且循环无细胞d
3、已经开发了两大类方法来测量dna甲基化。富集策略使用5mc特异性抗体、甲基化敏感性限制酶或甲基化诱导的dna双链体稳定性变化来选择甲基化的dna片段。然后可通过qpcr或其他标准核酸定量策略相对于非富集样本测量甲基化dna片段。基于化学转化的甲基化测定通过用化学或酶试剂处理样本开始，该化学或酶试剂在甲基化和非甲基化胞嘧啶残基之间产生碱基配对的差异。当前用于检测5mc和5hmc的黄金标准方法为亚硫酸氢盐测序，该测序将序列中的任何未甲基化的c转化成尿嘧啶(u)，但不将5mc或5hmc转化成对应的尿嘧啶衍生物。当使用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)扩增序列时，尿嘧啶扩增为胸苷(t)，并且因此将未甲基化的c测序为t。比较起来，5mc和5hmc扩增为c，并且因此测序为c。因此，序列中的任何c可以因为它们尚未转化成u而识别为对应于5mc或5hmc。此类流程可因为任何未甲基化的c被转化成t被称为“三碱基(three-base)”测序流程。然而，这种类型的流程降低序列复杂度并且可以导致测序质量降低、定位率降低、和序列覆盖相对不均匀。
4、尽管dna甲基化在许多人类疾病的病因学中是重要的，并且鉴定用于癌症和其他病症的数百种甲基化生物标志物，但仅少数基于甲基化的诊断测定已被用于临床。这种差异的主要原因是与snp和其他dna序列变化相比，测量胞嘧啶甲基化相对困难。胞嘧啶甲基化是核碱基结构中相对较小的化学变化，并且其本身不改变控制特异性碱基配对的氢键供体和受体的模式。
技术实现思路
1、本文提供的示例涉及使用与甲基胞嘧啶相对的经修饰的碱基检测甲基胞嘧啶。公开了用于进行此类检测的组合物和方法。
2、本文的一些示例提供了用于检测包括多个胞嘧啶的第一多核苷酸中的甲基胞嘧啶的方法。该方法可包括将第一多核苷酸与第二多核苷酸杂交。第二多核苷酸包括与甲基胞嘧啶相对的经修饰的碱基。该方法可包括使用经修饰的碱基检测甲基胞嘧啶。
3、在一些示例中，经修饰的碱基包括荧光团。在一些示例中，使用响应于激发光的来自荧光团的荧光来检测甲基胞嘧啶。在一些示例中，使用第一蛋白诱导荧光。在一些示例中，第一蛋白偶联到甲基胞嘧啶。在一些示例中，第一蛋白与甲基胞嘧啶的偶联使甲基胞嘧啶从经修饰的碱基解离，而第一多核苷酸保持与第二多核苷酸杂交。在一些示例中，响应于甲基胞嘧啶从经修饰的碱基的解离，荧光团以第一强度和第一波长发出荧光。在一些示例中，当第一多核苷酸保持与第二多核苷酸杂交时，响应于甲基胞嘧啶从经修饰的碱基的解离，荧光团以第二强度和第二波长发出荧光。在一些示例中，第二强度不同于第一强度。附加地或另选地，在一些示例中，第二波长不同于第一波长。
4、附加地或另选地，在一些示例中，经修饰的碱基包括溶剂化显色核苷。
5、附加地或另选地，在一些示例中，经修饰的碱基包括经修饰的鸟嘌呤或经修饰的腺嘌呤。
6、附加地或另选地，在一些示例中，经修饰的碱基包括第一靶标。在一些示例中，该方法还包括将甲基胞嘧啶偶联到第一蛋白。第一蛋白可偶联到第二蛋白，并且当第一蛋白偶联到甲基胞嘧啶时，第二蛋白选择性地结合到第一靶标。在一些示例中，荧光团偶联到第二蛋白。另选地，在一些示例中，第二蛋白包括第二靶标。荧光团可偶联到第三蛋白，该第三蛋白选择性地结合到第二靶标。在一些示例中，第二靶标包括表位，并且其中第三蛋白包括抗体。附加地或另选地，在一些示例中，第一蛋白和第二蛋白包括融合蛋白的不同部分。附加地或另选地，在一些示例中，第一蛋白通过第二接头偶联到第二蛋白。附加地或另选地，在一些示例中，第二蛋白包括snap蛋白并且第一靶标包括o-苄基鸟嘌呤。另选地，在一些示例中，第二蛋白包括clip蛋白并且第一靶标包括o-苄基胞嘧啶。另选地，在一些示例中，第二蛋白包括spytag并且第一靶标包括spycatcher，或者第二蛋白包括spycatcher并且第一靶标包括spytag。另选地，在一些示例中，第二蛋白包括生物素并且第一靶标包括链霉抗生物素蛋白，或者第二蛋白包括链霉抗生物素蛋白并且第一靶标包括生物素。另选地，在一些示例中，第二蛋白包括nta并且其中第一靶标包括his-tag，或者第二蛋白包括his-tag并且第一靶标包括nta。
7、附加地或另选地，在一些示例中，第一蛋白偶联到分裂荧光团的第一半部；第二蛋白偶联到分裂荧光团的第二半部；并且当第一蛋白变得偶联到甲基胞嘧啶以诱导荧光时，分裂荧光团的第一半部变得偶联到分裂荧光团的第二半部。
8、附加地或另选地，在一些示例中，第一蛋白包括甲基结合蛋白(mbp)。
9、附加地或另选地，在一些示例中，第一蛋白包括set和环指相关(sra)结构域。
10、附加地或另选地，在一些示例中，在第一多核苷酸与第二多核苷酸杂交后，经修饰的碱基偶联到荧光团。
11、附加地或另选地，在一些示例中，第二多核苷酸直接偶联到基底。附加地或另选地，在一些示例中，第二多核苷酸与直接偶联到基底的第三多核苷酸杂交。在一些示例中，基底偶联到包括鉴定第一多核苷酸的代码的寡核苷酸。在一些示例中，寡核苷酸与第二多核苷酸分开地偶联到基底。在一些示例中，寡核苷酸将第二多核苷酸偶联到基底。附加地或另选地，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测包含多个胞嘧啶的第一多核苷酸中的甲基胞嘧啶的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括荧光团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使用响应于激发光的来自所述荧光团的荧光来检测所述甲基胞嘧啶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用第一蛋白诱导所述荧光。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一蛋白偶联到所述甲基胞嘧啶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一蛋白与所述甲基胞嘧啶的所述偶联使所述甲基胞嘧啶从所述经修饰的碱基解离，而所述第一多核苷酸保持与所述第二多核苷酸杂交。
7.根据权利要求6所述的方法，其中响应于所述甲基胞嘧啶从所述经修饰的碱基的所述解离，所述荧光团以第一强度和第一波长发出荧光。
8.根据权利要求7所述的方法，其中当所述第一多核苷酸保持与所述第二多核苷酸杂交时，响应于所述甲基胞嘧啶从所述经修饰的碱基的所述解离，所述荧光团以第二强度和第二波长发出荧光。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二强度不同于所述第一强度
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述第二波长不同于所述第一波长。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括溶剂化显色核苷。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括经修饰的鸟嘌呤或经修饰的腺嘌呤。
13.根据权利要求1或权利要求12所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括第一靶标。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括将所述甲基胞嘧啶偶联到第一蛋白，其中所述第一蛋白偶联到第二蛋白，并且其中当所述第一蛋白偶联到所述甲基胞嘧啶时，所述第二蛋白选择性地结合到所述第一靶标。
15.根据权利要求14所述的方法，其中荧光团偶联到所述第二蛋白。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二蛋白包括第二靶标，其中所述荧光团偶联到第三蛋白，所述第三蛋白选择性地结合到所述第二靶标。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二靶标包括表位，并且其中所述第三蛋白包括抗体。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白包括融合蛋白的不同部分。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白通过第二接头偶联到所述第二蛋白。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括SNAP蛋白并且其中所述第一靶标包括O-苄基鸟嘌呤。
21.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括CLIP蛋白并且其中所述第一靶标包括O-苄基胞嘧啶。
22.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括SpyTag并且其中所述第一靶标包括SpyCatcher，或者其中所述第二蛋白包括SpyCatcher并且其中所述第一靶标包括SpyTag。
23.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括生物素并且所述第一靶标包括链霉抗生物素蛋白，或者其中所述第二蛋白包括链霉抗生物素蛋白并且所述第一靶标包括生物素。
24.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括NTA并且其中所述第一靶标包括His-Tag，或者其中所述第二蛋白包括His-Tag并且所述第一靶标包括NTA。
25.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中：
26.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白包括甲基结合蛋白(MBP)。
27.根据权利要求13至26中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白包括SET和环指相关(SRA)结构域。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸杂交后，所述经修饰的碱基偶联到荧光团。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸直接偶联到基底。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸与直接偶联到基底的第三多核苷酸杂交。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述基底偶联到包括鉴定所述第一多核苷酸的代码的寡核苷酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述第二多核苷酸分开地偶联到所述基底。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述寡核苷酸将所述第二多核苷酸偶联到所...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于检测包含多个胞嘧啶的第一多核苷酸中的甲基胞嘧啶的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括荧光团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使用响应于激发光的来自所述荧光团的荧光来检测所述甲基胞嘧啶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中使用第一蛋白诱导所述荧光。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一蛋白偶联到所述甲基胞嘧啶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一蛋白与所述甲基胞嘧啶的所述偶联使所述甲基胞嘧啶从所述经修饰的碱基解离，而所述第一多核苷酸保持与所述第二多核苷酸杂交。
7.根据权利要求6所述的方法，其中响应于所述甲基胞嘧啶从所述经修饰的碱基的所述解离，所述荧光团以第一强度和第一波长发出荧光。
8.根据权利要求7所述的方法，其中当所述第一多核苷酸保持与所述第二多核苷酸杂交时，响应于所述甲基胞嘧啶从所述经修饰的碱基的所述解离，所述荧光团以第二强度和第二波长发出荧光。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二强度不同于所述第一强度。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述第二波长不同于所述第一波长。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括溶剂化显色核苷。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括经修饰的鸟嘌呤或经修饰的腺嘌呤。
13.根据权利要求1或权利要求12所述的方法，其中所述经修饰的碱基包括第一靶标。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括将所述甲基胞嘧啶偶联到第一蛋白，其中所述第一蛋白偶联到第二蛋白，并且其中当所述第一蛋白偶联到所述甲基胞嘧啶时，所述第二蛋白选择性地结合到所述第一靶标。
15.根据权利要求14所述的方法，其中荧光团偶联到所述第二蛋白。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二蛋白包括第二靶标，其中所述荧光团偶联到第三蛋白，所述第三蛋白选择性地结合到所述第二靶标。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二靶标包括表位，并且其中所述第三蛋白包括抗体。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白和所述第二蛋白包括融合蛋白的不同部分。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白通过第二接头偶联到所述第二蛋白。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括snap蛋白并且其中所述第一靶标包括o-苄基鸟嘌呤。
21.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括clip蛋白并且其中所述第一靶标包括o-苄基胞嘧啶。
22.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括spytag并且其中所述第一靶标包括spycatcher，或者其中所述第二蛋白包括spycatcher并且其中所述第一靶标包括spytag。
23.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括生物素并且所述第一靶标包括链霉抗生物素蛋白，或者其中所述第二蛋白包括链霉抗生物素蛋白并且所述第一靶标包括生物素。
24.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述第二蛋白包括nta并且其中所述第一靶标包括his-tag，或者其中所述第二蛋白包括his-tag并且所述第一靶标包括nta。
25.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中：
26.根据权利要求13至25中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白包括甲基结合蛋白(mbp)。
27.根据权利要求13至26中任一项所述的方法，其中所述第一蛋白包括set和环指相关(sra)结构域。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中在所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸杂交后，所述经修饰的碱基偶联到荧光团。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸直接偶联到基底。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述第二多核苷酸与直接偶联到基底的第三多核苷酸杂交。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述基底偶联到包括鉴定所述第一多核苷酸的代码的寡核苷酸。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述第二多核苷酸分开地偶联到所述基底。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述寡核苷酸将所述第二多核苷酸偶联到所述基底。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述基底包括小珠。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中使用所述经修饰的碱基检测所述甲基胞嘧啶包括使用所述代码鉴定所述第一多核苷酸。
36.一种组合物，所述组...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·布朗，S·舒尔扎贝格，E·布拉斯塔德，
申请(专利权)人：因美纳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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