【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用原子力显微镜检测附着于固体基底的寡核苷酸双链体中是否存在错配对的装置和方法。具体而言，本专利技术的方法和装置允许通过使用包含afm悬臂的原子力显微镜来定性和定量分析寡核苷酸双链体样品中错配对的存在，所述afm悬臂包含dna错配修复蛋白。本专利技术的方法和装置允许检测基因突变，而无需扩增、标记或修饰样品。这种装置和方法可用于多种临床诊断应用，包括但不限于检测和/或分析与癌症、创伤、败血症、无菌性炎症、心肌梗塞、中风、移植、糖尿病、镰状细胞病以及其他临床病症相关的生物标志物。
技术介绍
1、循环游离dna或无细胞dna(cfdna)是释放到血浆中的降解dna片段。示例性cfdna包括但不限于循环肿瘤dna(ctdna)和无细胞胎儿dna(cffdna)。特别值得注意的是，在癌症中观察到cfdna水平升高，尤其是在疾病的晚期。也有证据表明，cfdna随着年龄的增长而增加。
2、cfdna已被证明是多种临床病症的有用生物标志物，所述临床病症包括但不限于癌症、创伤、败血症、无菌性炎症、心肌梗塞、中风、移植、糖尿病、镰状细胞病以及其他临床病症。其他有用的cfdna包括不仅用于确定妇女是否怀孕，还用于确定任何胎儿异常存在的cffdna。cfdna主要是dna的双链细胞外分子，由小片段(70到200bp)和大片段(21kb)组成。
3、正如预期的那样，无细胞dna分析，例如无细胞循环肿瘤dna(ctdna)分析，为癌症的非侵入性早期评估提供了巨大的机会，所述癌症例如但不限于前列腺癌、乳腺癌、结肠癌以及其
4、目前，基于pcr的方法已经引领了该领域，并且达到的检测限(“lod”)是令人鼓舞的。然而，不幸的是，基于pcr的方法在扩增步骤中引入了其自身的突变，并且在数据分析过程中引入了不期望的人为因素，导致灵敏度和/或特异性不理想。
5、因此，需要提高在不使用基于pcr的方法的情况下确定cfdna中任何异常存在的灵敏度和/或特异性。特别是，需要一种无需扩增、标记或修饰就能检测基因突变的装置和方法。
技术实现思路
1、本专利技术的一些方面基于本专利技术人的发现，其中其悬臂尖端包含dna错配修复蛋白的原子力显微镜(afm)提供了对错配寡核苷酸双链体的极其灵敏和选择性的检测，而无需任何标记、扩增(例如，通过pcr)或修饰。本专利技术的方法和装置允许定量和定性分析，以确定错配寡核苷酸双链体的存在。
2、本专利技术的一个具体方面提供了一种确定附着于固体基质的寡核苷酸双链体中是否存在错配对的方法，所述方法包括：
3、用具有包含dna错配修复蛋白的afm尖端的原子力显微镜(afm)扫描所述固体基底，以产生力图；和
4、分析所述力图以确定所述寡核苷酸双链体中是否存在错配。
5、在一些实施方案中，该方法用于确定样品中错配寡核苷酸双链体的水平。在其它实施方案中，所述dna错配修复蛋白是原核错配修复蛋白。在某些情况下，所述dna错配修复蛋白包含muts或其同源物。
6、在其它实施方案中，所述dna错配修复蛋白是真核错配修复蛋白。在某些情况下，所述dna错配修复蛋白包含msh2、msh3、msh4或msh6。
7、本专利技术的另一方面提供了一种原子力显微镜(afm)悬臂尖端，所述尖端包含组氨酸标记的dna错配修复蛋白。在一些实施方案中，所述dna错配修复蛋白是原核错配修复蛋白。在一个特定的示例中，所述dna错配修复蛋白包括muts或其同源物。
8、在其他实施方案中，所述dna错配修复蛋白是真核错配修复蛋白。在一个具体实施方案中，所述dna错配修复蛋白包含msh2、msh3、msh4或msh6。
9、在其他实施方案中，所述组氨酸标记的dna错配修复蛋白通过接头连接到所述afm悬臂尖端。
10、在某些实施方案中，通过所述组氨酸标记与ni(ii)离子的络合，所述组氨酸标记的dna错配修复蛋白被固定到所述afm悬臂尖端。
11、本专利技术的另一方面提供了一种检测样品中是否存在基因突变的方法，所述方法包括：
12、在足以形成靶-探针寡核苷酸双链体的条件下，将所述样品与包含探针寡核苷酸的固体基质接触，其中所述探针寡核苷酸包含野生型基因的互补寡核苷酸序列；
13、使用原子力显微镜(afm)测量所述靶-探针寡核苷酸双链体和dna错配修复蛋白之间的相互作用水平；和
14、分析所述相互作用水平以确定是否存在错配的靶-探针寡核苷酸双链体，
15、其中错配的靶-探针寡核苷酸双链体的存在表明所述样品中存在基因突变。
16、在一些实施方案中，所述探针寡核苷酸包含选自ras、egfr和pik3ca的野生型基因的互补寡核苷酸。在某些情况下，所述ras基因选自kras、hras、nras、r-ras、m-ras、e-ras、di-ras1、di-ras2、nkiras1、nkiras2、tc21、rap1、rap2、rit1、rit2、rem1、rem2、rad、gem、rheb1、rheb2、noey2、r-ras、rerg、rala、ralb、rasd1、rasd2、rrp22、rasl10b、rasl11a、rasl11b、ris/rasl12和flj22655。在一个具体的实施方案中，所述方法检测kras基因第12或13位密码子的突变。在另一个实施方案中，所述方法检测kras基因第12位密码子的突变。
17、如本文所述，本专利技术的方法和装置利用取自受试者的样品，而无需标记或扩增。因此，本专利技术的方法和设备避免了由标记或扩增过程中可能引入的误差。在一些实施方案中，所述方法的特异性为至少约90％，通常至少约95％，通常至少约98％，最通常至少约99％。在其它实施方案中，所述方法的灵敏度为至少约90％，通常至少约95％，通常至少约98％，最通常至少约99％。
18、在其它实施方案中，本专利技术的方法能够检测所述样品中存在0.1％或更少、通常0.05％或更少、通常0.01％或更少、最通常0.001％或更少的突变。
19、在其它实施方案中，所述样品用于检测基因突变的存在，而无需扩增、标记或修饰。在其他实施方案中，所述样品用于检测基因突变的存在，而无需扩增或标记。
20、本专利技术的另一方面提供了一种诊断受试者是否患有癌症的方法，所述方法包括：
21、当所述样品中存在靶寡核苷酸时，在足以形成靶-探针寡核苷酸双链体的条件下，将从受试者获得的流体样品与包含探针寡核苷酸的固体基质接触，其中所述探针寡核苷酸包含野生型ras基因的至少一部分；和
22、用原子力显微镜(afm)分析所述靶-探针寡核苷酸双链体中是否存在错配的靶-探针寡核苷酸双链体，所述afm包含附着在所述afm悬臂上的dna错配修复蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于确定附着于固体基质的寡核苷酸双链体中错配存在的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA错配修复蛋白是原核错配修复蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA错配修复蛋白包括MutS或其同源物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA错配修复蛋白是真核错配修复蛋白。
5.原子力显微镜(AFM)悬臂尖端，包含组氨酸标记的DNA错配修复蛋白。
6.根据权利要求5所述的AFM悬臂尖端，其中所述DNA错配修复蛋白是原核错配修复蛋白。
7.根据权利要求6所述的AFM悬臂尖端，其中所述DNA错配修复蛋白包括MutS或其同源物。
8.根据权利要求5所述的AFM悬臂尖端，其中所述DNA错配修复蛋白是真核错配修复蛋白。
9.根据权利要求5所述的AFM悬臂尖端，其中所述组氨酸标记的DNA错配修复蛋白通过接头连接到所述AFM悬臂尖端。
10.根据权利要求6所述的悬臂尖端的AFM，其中所述组氨酸标记的DNA错配修复蛋白通过所述组氨酸标签与Ni(II
11.一种用于检测样品中基因突变存在的方法，所述方法包括：
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述探针寡核苷酸包含选自Ras、EGFR和PIK3CA的野生型基因的互补寡核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述Ras基因选自KRas、HRas、NRas、R-Ras、M-Ras、E-ras、Di-Ras1、Di-Ras2、NKIRas1、NKIRas2、TC21、Rap1、Rap2、Rit1、Rit2、Rem1、Rem2、Rad、Gem、Rheb1、Rheb2、Noey2、R-Ras、Rerg、RalA、RalB、RasD1、RasD2、RRP22、RasL10B、RasL11A、RasL11B、Ris/RasL12和FLJ22655。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法检测KRas基因的第12或13位密码子的突变。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法检测KRas基因第12位密码子的突变。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法的特异性为至少约90％。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法的灵敏度为至少约90％。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述方法能够检测所述样品中存在的0.1％或更少的突变。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述样品用于检测基因突变的存在，而无需扩增、标记或修饰。
20.一种诊断受试者是否患有癌症的方法，所述方法包括：
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述野生型Ras基因包含野生型KRas基因。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法用于确定KRas基因的第12或13位密码子是否存在突变。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法用于确定是否存在G12D、G12A、G12R、G12C、G12S、G12V、G13D或其组合。
24.根据权利要求19所述的方法，其中将所述流体样品与所述固体基质接触的步骤还包括当所述突变的Ras基因存在于所述流体样品中时，在足以选择性形成阻断探针-突变的Ras基因双链体和单链突变的Ras基因的条件下，将所述流体样品与阻断探针接触的步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述阻断探针包括锁核酸/DNA(“LNA/DNA”)嵌合阻断探针。
26.根据权利要求25所述的方法，其中LNA/DNA嵌合阻断探针-正常Ras基因双链体和LNA/DNA嵌合阻断探针-突变Ras基因双链体之间的解链温差为至少10℃。
27.一种用于检测受试者中基因突变的装置，所述装置包括：
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述探针寡核苷酸包括用于检测KRas基因第12或13位密码子突变的寡核苷酸。
29.根据权利要求27所述的装置，其中所述探针寡核苷酸包含约10至500个核苷酸。
30.根据权利要求29所述的装置，其中所述探针寡核苷酸包含约20至250个核苷酸。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于确定附着于固体基质的寡核苷酸双链体中错配存在的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna错配修复蛋白是原核错配修复蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述dna错配修复蛋白包括muts或其同源物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna错配修复蛋白是真核错配修复蛋白。
5.原子力显微镜(afm)悬臂尖端，包含组氨酸标记的dna错配修复蛋白。
6.根据权利要求5所述的afm悬臂尖端，其中所述dna错配修复蛋白是原核错配修复蛋白。
7.根据权利要求6所述的afm悬臂尖端，其中所述dna错配修复蛋白包括muts或其同源物。
8.根据权利要求5所述的afm悬臂尖端，其中所述dna错配修复蛋白是真核错配修复蛋白。
9.根据权利要求5所述的afm悬臂尖端，其中所述组氨酸标记的dna错配修复蛋白通过接头连接到所述afm悬臂尖端。
10.根据权利要求6所述的悬臂尖端的afm，其中所述组氨酸标记的dna错配修复蛋白通过所述组氨酸标签与ni(ii)离子的络合作用而被固定到所述afm悬臂尖端。
11.一种用于检测样品中基因突变存在的方法，所述方法包括：
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述探针寡核苷酸包含选自ras、egfr和pik3ca的野生型基因的互补寡核苷酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述ras基因选自kras、hras、nras、r-ras、m-ras、e-ras、di-ras1、di-ras2、nkiras1、nkiras2、tc21、rap1、rap2、rit1、rit2、rem1、rem2、rad、gem、rheb1、rheb2、noey2、r-ras、rerg、rala、ralb、rasd1、rasd2、rrp22、rasl10b、rasl11a、rasl11b、ris/rasl12和flj22655。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法检测kras基因的第12或13位密码子的突变。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：朴俊元，绍拉夫·米什拉，昌吉尔·班，
申请(专利权)人：浦项科技大学研究与商业发展基金会，
类型：发明
国别省市：
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