【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其是涉及一种利用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法和应用。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cell，mscs)是一种具有自我更新能力、且具有多向分化潜能的原始细胞，来源于发育早期的中胚层。它的来源广泛，可从骨髓、脐带、脂肪以及牙髓等组织中提取获得。间充质干细胞的功能包括归巢至机体损伤位点、促进微环境再生、免疫调节、及多系分化潜能，被广泛应用于血液相关疾病、自身免疫性疾病和组织工程等。为了满足临床对间充质干细胞数量的需求，在体外大规模培养并获得足够数量和高质量的细胞十分关键。通常，体外培养细胞方法主要用培养瓶静态培养，但是该培养方法存在较多的缺点，如培养瓶用量大、需要宽敞的培养环境和大量的人力，且规模难以放大等。
2、相关研究表明，利用生物反应器培养体系再配合微载体供贴壁细胞生长，可以替代静态培养方式，其能获得符合gmp级别且数量达到1010以上的细胞。与传统的静态培养方式相比，利用生物反应器进行细胞的悬浮搅拌式扩增培养，不仅可以在培养过程中控制和监测工艺参数，如温度(t)、溶解氧(do)、ph和搅拌速度等，而且可以进行等比例扩大培养体积，确保细胞质量一致。然而相关技术中，利用生物反应器培养体系扩培过程中需要添加大量的微载体，这不仅增加了培养成本，而且增加了分离纯化目标细胞的难度，不利于间充质干细胞的工业化生产。
3、基于此，亟需寻求一种低成本、高产量的大规模连续流培养细胞方法。
技术实现思路p>
1、本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种利用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法，采用该方法仅需要少量的微载体就能够一次性获得质量一致的、数量达1010的细胞。
2、本专利技术还提出上述利用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法在生物制药中的应用。
3、本专利技术的第一方面，提供了一种应用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法，包括以下步骤：
4、步骤s1、将复苏的细胞以0.4×105～0.6×105个/ml的终密度接种至含微载体的初级生物反应器中培养至稳态，然后以10～20ml/min的气体流速通入空气和二氧化碳气体混合气，继续培养5～7天，分离细胞，获得第一细胞悬浮液；
5、步骤s2、将所述第一细胞悬浮液转移至含微载体的次级生物反应器中培养至稳态，然后以15～30ml/min的气体流速通入空气、二氧化碳和氧气混合气，继续培养5～7天，分离细胞，获得第二细胞悬浮液；
6、步骤s3、将所述第二细胞悬浮液等量接种至含微载体的三级生物反应器中培养至稳态，然后以40～100ml/min的气体流速通入空气、二氧化碳和氧气混合气，继续培养5～7天，分离细胞，即得；
7、其中，所述初级生物反应器、二级生物反应器和三级生物反应器中的所述微载体的终浓度独立为0.5～2g/l。
8、根据本专利技术实施例的方法，至少具有如下有益效果：本专利技术通过合理调控细胞扩增过程中各阶段的气体流量，在低微载体浓度和细胞接种浓度情况下，采用自动化连续培养细胞的方式一次性获得质量一致、数量达1010的细胞，且细胞活性可达到90％以上，为实现细胞的快速、高质量扩增提供了有效途径。
9、在本专利技术的一些实施方式中，所述微载体的终浓度独立为1.5～2g/l。
10、在本专利技术的一些实施方式中，所述微载体的终浓度独立为1.5～1.8g/l。
11、在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。
12、在本专利技术的一些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自人源间充质干细胞、hek293细胞、非洲绿猴肾细胞、per.c6细胞、mdck细胞中的至少一种。
13、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1～s3中，所述培养的温度为36～37.5℃。
14、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1～s3中，所述培养的ph为7.3～7.5。
15、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1～s3中，所述培养的过程中采用间歇式搅拌方式和持续性搅拌方式结合的搅拌方式。
16、在本专利技术的一些实施方式中，所述间歇式搅拌方式为：以20～40rpm的转速搅拌5～10min，停止50～55min，循环次数为3～5次。
17、在本专利技术的一些实施方式中，所述持续性搅拌方式为：以20～40rpm的转速搅拌至培养结束。
18、在本专利技术的一些实施方式中，所述培养的过程中先采用间歇式搅拌方式后采用持续性搅拌方式进行搅拌。
19、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1～s3中，所述稳态时的所述细胞的增量为所述细胞接种量的8～12倍。
20、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1中，所述空气和二氧化碳混合气采用表面通气方式通入。
21、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s2中，所述空气、二氧化碳和氧气混合气采用深层通气方式通入。
22、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s3中，所述空气、二氧化碳和氧气混合气采用表面通气方式和深层通气方式结合通入。
23、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1～s3中，所述分离细胞的方式包括：先对所述细胞进行酶消化，再利用截留装置分离所述细胞和所述微载体。
24、在本专利技术的一些实施方式中，所述截留装置的微孔直径为20～200μm。
25、在本专利技术的一些实施方式中，所述截留装置的材质选自玻璃材质、陶瓷材质、尼龙材质、无纺布材中的至少一种。
26、在本专利技术的一些实施方式中，在利用截留装置分离所述细胞和所述微载体过程中，一旦发现微载体堆积在截留装置周围，向反应器中通入无菌空气，使堆积的微载体成漂浮运动状态。如此方式，反复通入空气，防止微载体阻塞截留装置。
27、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1～s3中，所述分离细胞后还包括采用细胞浓缩洗滤装置收集所述细胞。
28、在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞浓缩洗滤装置包括切向流膜过滤系统(tangential flow filtration，tff)或交错切向流细胞截留系统(alternatingtangential flow filtration system，atf)。
29、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s1中，所述细胞浓缩洗滤装置的流速为80～120ml/min，泵速为100～120rpm，浓缩倍数为4～5倍。
30、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s2中，所述细胞浓缩洗滤装置的流速为80～120ml/min，泵速为100～120rpm，浓缩倍数为8～12倍。
31、在本专利技术的一些实施方式中，步骤s3中，所述细胞浓缩洗滤装置的流速为180～200ml/min，泵速为180～200rpm，浓缩倍数为8～12倍。
32、在本专利技术的一些实施方式中，所述细胞悬浮液的缓冲溶液为pbs溶液，可以理解的是，pbs的ph值可本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1～S3中，所述培养的温度为36～37.5℃；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1～S3中，所述培养的过程中采用间歇式搅拌方式和持续性搅拌方式结合的搅拌方式；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1～S3中，所述稳态时的所述细胞的增量为所述细胞接种量的8～12倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述空气和二氧化碳混合气采用表面通气方式通入；
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，步骤S1～S3中，所述分离细胞的方式包括：先对所述细胞进行酶消化，再利用截留装置分离所述细胞和所述微载体；
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述细胞浓缩洗滤装置的流速为80～120mL/min，泵速为100～120rpm，浓缩倍数为4～5倍；p>
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述初级生物反应器的容量为100～500mL；
10.如权利要求1至9任一项所述的利用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法在生物制药中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种利用生物反应器大规模连续流培养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1～s3中，所述培养的温度为36～37.5℃；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1～s3中，所述培养的过程中采用间歇式搅拌方式和持续性搅拌方式结合的搅拌方式；
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1～s3中，所述稳态时的所述细胞的增量为所述细胞接种量的8～12倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中...
【专利技术属性】
技术研发人员：王颖，曹毓琳，赵鹏伟，李伟，滕睿頔，刘凤姣，
申请(专利权)人：唐颐控股深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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