【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及蓝莓落果相关病毒荧光定量pcr检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、实时荧光定量pcr(real-time fluorescent quantitative pcr，qpcr)技术是在聚合酶链式反应体系中加入荧光标记物质，随着产物的扩增，通过对收集到的荧光信号进行实时监测并利用标准曲线对未知的dna模板进行定性定量的一种新型的生物学检测技术。根据荧光模式不同，可将其分为荧光染料法和荧光探针法。与聚合酶链式反应相比，该技术具有灵敏度高、特异性强、能精确定量等特点，且可以有效地避免了污染。该技术不仅应用于植物病理学中的真菌、细菌等，而且在病毒领域得到广泛应用。
2、实时荧光定量pcr检测技术不仅操作简单、快速高效，而且具有极高的灵敏度和特异性。实时荧光定量pcr检测方法在试验过程中所使用的sybr green i是一种操作简单、高灵敏、适用范围广、经济实惠的染料，有关数据显示，该染料与dsdna相结合时，荧光信号会增强800-1000倍，其灵敏度要比eb高出25-100倍，且毒性比eb染料低。sybr green i与荧光探针相比，不需要设计特异性探针及其配套引物，大大缩短了试验时间与科研经费。另外由于整个扩增阶段处于封闭环境，很大程度上降低了外界条件对试验的污染。
3、蓝莓落果相关病毒(blueberry fruit drop associated virus，bfdav)是花椰菜病毒科(broccoliviridae)的代表成员之一，是一种主要侵染月季花的dsdna病毒，且具有传播
4、因此建立一种快速、高效、定量的蓝莓落果相关病毒检测技术有助于早期发现该病毒并进行有效防治。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是如何检测蓝莓落果相关病毒和/或如何高效检测蓝莓落果相关病毒和/或如何定量检测蓝莓落果相关病毒。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了定量检测蓝莓落果相关病毒的试剂盒。所述试剂盒可包括检测蓝莓落果相关病毒的组合物。所述组合物可包括引物s5-f和s5-r。所述引物s5-f的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述引物s5-r的核苷酸序列可如序列表中序列3所示。
3、上述试剂盒中，所述组合物还可包括蓝莓落果相关病毒的标准品。所述标准品可为含有蓝莓落果相关病毒dna的重组质粒。
4、上述试剂盒中，所述组合物还可包括荧光染料。所述荧光染料可为sybr green i。
5、为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了定量检测蓝莓落果相关病毒的系统。所述系统可含有上文所述的试剂盒和/或上述组合物和荧光定量pcr仪。
6、上文所述的检测蓝莓落果相关病毒的组合物也属于本专利技术的保护范围。
7、上述组合物的各组分可为液体和/或固体粉末。所述检测可为定量检测，也可为定性检测。
8、为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了定量检测蓝莓落果相关病毒的方法。所述方法可包括使用上文所述的引物s5-f和s5-r对待测样本的dna或cdna进行荧光定量pcr，使用上文所述的标准品制作标准曲线，通过所述标准曲线对所述待测样本中蓝莓落果相关病毒进行定量的步骤。
9、上述方法中，所述标准曲线的横坐标为荧光定量pcr测得的ct值，纵坐标可为标准品拷贝数(浓度)的对数值。所述标准曲线的制作方法可包括将所述标准品进行浓度梯度稀释得到不同浓度梯度的标准品，对所述不同浓度梯度的标准品使用所述所述引物s5-f和s5-r进行荧光定量pcr的步骤。
10、上文所述的试剂盒和/或上文所述的组合物在蓝莓落果相关病毒检测或辅助检测中的应用也属于本专利技术的保护范围。
11、上文所述的试剂盒和/或上文所述的组合物在制备检测或辅助检测蓝莓落果相关病毒产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。
12、本研究通过对普通pcr检测所需bfdav引物进行测序所得序列进行引物设计出一对特异性引物，采用sybr green i染料法建立了bfdav实时荧光定量pcr检测体系。可以快速高效地进行疑似月季病毒样品的检测，且具有较高的灵敏性和特异性，病毒最低检测浓度为1.86×103fg/ul，可应用于制备检测或辅助检测蓝莓落果相关病毒产品。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.检测蓝莓落果相关病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测蓝莓落果相关病毒的组合物；所述组合物包括引物S5-F和引物S5-R；所述引物S5-F是核苷酸序列是序列表中序列2的单链DNA；所述引物S5-R是核苷酸序列是序列表中序列3的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括蓝莓落果相关病毒的标准品；所述标准品为含有序列1的DNA分子的载体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括荧光染料。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为SYBRGreen I。
5.检测蓝莓落果相关病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和荧光定量PCR仪。
6.权利要求1-4中任一权利要求中所述的检测蓝莓落果相关病毒的组合物。
7.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和/或权利要求6所述的组合物，其特征在于：所述组合物的各组分为液体和/或固体粉末。
8.定量检测蓝莓落果相关病毒的方
9.权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和/或权利要求6所述的组合物在蓝莓落果相关病毒检测或辅助检测中的应用。
10.权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和/或权利要求6所述的组合物在制备检测或辅助检测蓝莓落果相关病毒产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.检测蓝莓落果相关病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测蓝莓落果相关病毒的组合物；所述组合物包括引物s5-f和引物s5-r；所述引物s5-f是核苷酸序列是序列表中序列2的单链dna；所述引物s5-r是核苷酸序列是序列表中序列3的单链dna。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括蓝莓落果相关病毒的标准品；所述标准品为含有序列1的dna分子的载体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述组合物还包括荧光染料。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为sybrgreen i。
5.检测蓝莓落果相关病毒的系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1-4中任一权利要求所述的试剂盒和荧光定量pcr仪。
6.权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：石延霞，李宝聚，柴阿丽，谢学文，李磊，宋浩，温智浩，范腾飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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