一种改善RPA反应特异性的方法技术

本发明专利技术公开了一种改善RPA反应特异性的方法，包括在上下游引物中间设计第一探针与第二探针，所述第一探针为与目的片段相同或反向的序列，第一探针距离5端25‑40nt的位置使用脱碱基核苷酸类似物替代原有的碱基；第二探针设计在与第一探针互补的链上，距离5端25‑40nt的位置使用脱碱基核苷酸类似物替代原有的碱基；第一探针与所述第二探针经核酸酶切割后形成一对扩增引物。本发明专利技术在上下游引物中间再引入一条探针，同时适当降低引物量，形成巢式扩增，减少因探针错配引起切割和延伸，从而减少非特异扩增和假阳性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，涉及rpa反应，尤其涉及一种改善rpa反应特异性的方法。

技术介绍

1、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification)是piepenburg等人在2006年开发出的一种核酸恒温扩增技术，被广泛应用于生命科学研究、临床诊断、食品安全检测等领域。rpa技术在病原体检测、基因突变分析、环境监测等方面具有重要的潜在应用价值。rpa技术主要依赖三种蛋白，分别为链置换聚合酶、重组酶以及单链结合蛋白，此外还需要重组加载蛋白、肌酸激酶、核酸酶，核酸酶用于探针法检测，其中nfo用于侧流层析试纸条检测，exo和fpg用于实时荧光检测。rpa反应温度在25℃-42℃，反应速度快，几分钟内产物即可达到可检测水平。

2、rpa最初使用两条引物进行扩增，由于反应全程在低温下进行，一旦引物错配结合将难以分开，导致非特异扩增或形成引物二聚体而出现假阳性。为解决此问题，在两条引物中间增加一条探针，在该探针距3’末端15nt的位置用一个脱碱基核苷酸类似物残基替代原有的a、t、c或g碱基，在此残基上下游各标记一个荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种改善RPA反应特异性的方法，其特征在于，所述方法包括在上下游引物中间设计第一探针与第二探针，所述第一探针为与目的片段相同或反向的序列，第一探针距离5端25-40nt的位置使用脱碱基核苷酸类似物替代原有的碱基，所述碱基距离探针3’末端15nt，探针3’末端使用修饰基团封闭；

2.根据权利要求1所述的一种改善RPA反应特异性的方法，其特征在于，当RPA反应使用荧光检测时，第一探针在脱碱基核苷酸类似物的5’端和3’端分别标记一个荧光基团和淬灭基团，第二探针不需要额外标记。

3.根据权利要求1所述的一种改善RPA反应特异性的方法，其特征在于，当RPA反应使用侧流层...

【技术特征摘要】

1.一种改善rpa反应特异性的方法，其特征在于，所述方法包括在上下游引物中间设计第一探针与第二探针，所述第一探针为与目的片段相同或反向的序列，第一探针距离5端25-40nt的位置使用脱碱基核苷酸类似物替代原有的碱基，所述碱基距离探针3’末端15nt，探针3’末端使用修饰基团封闭；

2.根据权利要求1所述的一种改善rpa反应特异性的方法，其特征在于，当rpa反应使用荧光检测时，第一探针在脱碱基核苷酸类似物的5’端和3’端分别标记一个荧光基团和淬灭基团，第二探针不需要额外标记。

3.根据权利要求1所述的一种改善rpa反应特异性的方法，其特征在于，当rpa反应使用侧流层析检测时，第一探针的5’末端标记第一抗原，第二探针5’末端标记与第一探针相异的第二抗原。

4.根据权利要求3所述的一种改善rpa反应特异性的方法，其特征在于，脱碱基核...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙龙，施新颜，胡丽华，黄贤，周旭，郑宜文，丁佳女，
申请(专利权)人：杭州百迈生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：