【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原检测。更具体地，涉及基于crispr/cas12a快速精准检测刚地弓形虫的试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、常见的刚地弓形虫检测技术有：
2、1、显微镜检查法：该方法通过检查患者体液或者组织中的弓形虫形态来诊断弓形虫病，常用的显微镜检查方法包括血液涂片检查、淋巴液活检和脑脊液检查等，这些方法需要专业的技术人员，耗时耗力，且敏感性较低。
3、2、血清学检查法：血清学检验是弓形虫病诊断的主要方法之一，目前常用的一些血清学检测方法存在一些缺点，elisa检测方法是国内外学者以及实验室检测弓形虫抗体最常用的方法，该种方法对于急性病例检出率较高，但类风湿因子阳性者易出现假阳性反应；染色试验(dye test，dt)需要用到活虫，操作人员有感染风险；间接荧光抗体试验（ifat）如有类风湿因子、抗核抗体阳性时，可引起假阳性反应；间接血凝试验（iha）重复性差和致敏红细胞不稳定；mat反应时需要大量的速殖子，反应时间长等，这些不足限制了其在基层大规模的使用。而且，免疫学现有技术的灵敏度也普遍低于核酸分子检测方法。
4、3、分子生物学检查: 基于529bp重复序列、b1等位点的pcr是目前实验室最常用的刚地弓形虫分子生物学检测方法，该技术的缺点是耗时长（扩增需要2-3小时，凝胶电泳20-25分钟），需要依赖于昂贵的pcr仪，对模板dna质量要求高，扩增阳性样品的测序也是一笔不小的花费；实时荧光定量pcr的缺点是耗时长，需要依赖于昂贵的实时荧光定量pcr仪和专业操作人员；lamp灵敏度高，且耗时
5、专利号：cn202110703245.0，专利名称一种基于等温扩增-crispr/cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用的专利技术专利申请，公开了一种用于特异性检测弓形虫dna的crrna，核苷酸序列如seqidno:1所示。同时本专利技术还提供了检测弓形虫dna的试剂盒，包括所述crrna、cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssdna。利用cas12a靶向切割靶标序列和切割任意单链dna序列的特性，通过crrna靶向弓形虫dna序列，激活cas12a活性，从而cas12a对fq-ssdna序列进行酶切，发出的荧光信号来指示检测样品中是否含有弓形虫dna。但是该技术的敏感性为100 copies/μl,敏感性低。
6、
技术实现思路
1、巢式pcr-测序检测法，需要依赖于昂贵的pcr仪，且花费时间长；镜检法敏感性低，容易出现漏检误检，耗费人力的问题；免疫学检测方法容易出现交叉污染的问题；现有等温扩增-crispr/cas12a技术检测弓形虫敏感性为100 copies/μl,敏感性低；本专利技术旨在提供一种等温扩增-crispr/cas12a技术检测弓形虫敏感性高的试剂盒及检测方法。
2、本专利技术研究发现，当刚地弓形虫的核酸与cas12a蛋白、以及特异的crrna结合，形成三元复合物后，cas12a蛋白的ruvc结构域将被激活，发挥非特异性单链dna切割功能，将带有荧光信号标记的单链dna（ssdna reporter）切割开。通过检测荧光或者观察试纸条上的检测线即可得知待检样品是否刚地弓形虫阳性。基于此，本专利技术构建了基于crispr/cas12a快速精准检测刚地弓形虫的方法，分别设计了最特异、最高效、最灵敏的优质rpa引物和crrna，保证了刚地弓形虫的检测效果。因此，本研究提供了分别用于刚地弓形虫检测的crrna，crrna序列见表1。所示crrna在检测刚地弓形虫中的应用，以及在制备刚地弓形虫检测产品中的应用，也均在本专利技术的保护范围之内。基于此，还提供了检测刚地弓形虫的crispr/cas12a系统，包括上述crrna及其组合。具体地，所述crispr/cas12a系统还包括rpa扩增引物对rpa-f/rpa-r，序列见表2。所述crispr/cas12a系统还包括单链荧光探针（hbreporter）和试纸条探针（fb reporter）,hb reporter序列为：hex-12n-bhq1，fb reporter序列为：fam-12n-biotin。所述crispr/cas12a系统还包括rpa扩增体系和crispr/cas12a检测系统所需试剂。
3、rpa扩增体系如下：下述表格的用量的确定值±10%都是允许范围
4、 试剂regents 用量volume（μl） buffer 29.5 无核酶水 8.2 上游引物（10nm） 2. 下游引物（10nm） 2.4 <![cdata[mg<sup>2+</sup>]]> 2.5 dna模板 5 合计 50
5、所述crispr/cas12a检测体系如下：下述表格的用量的确定值±10%都是允许范围
6、 试剂regents 用量volume（μl） 无核酶水 12 buffer 2 fncas12a 1 rna酶抑制剂 1 hb reporter 1 crrna 1 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于RPA-CRISPR/Cas12a检测刚地弓形虫的B1位点的靶点序列，其特征在于，所述靶点序列为刚地弓形虫的B1基因位点MH744807（反向互补链）的第 334 bp～第 357 bp位点的核苷酸序列；所述第 334 bp～第 357 bp位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
2.基于RPA-CRISPR/Cas12a检测扩增DNA的上下游引物对，其特征在于，所述刚地弓形虫的第一组上游引物F104-133的核苷酸序列为SEQ ID NO:2、对应下游引物R304-335为SEQID NO:3、第二组上游引物F101-132的核苷酸序列为SEQ ID NO:4、对应下游引物R297-328为SEQ ID NO:5、第三组上游引物F105-134的核苷酸序列为SEQ ID NO:6、对应下游引物R357-386为SEQ ID NO:7、第四组上游引物F91-120的核苷酸序列为SEQ ID NO:8、对应下游引物R354-385为SEQ ID NO:9、第五组上游引物F102-132的核苷酸序列为SEQ ID NO:10、对应下游引物R295-326
3.基于RPA-CRISPR/Cas12a检测刚地弓形虫DNA的crRNA，其特征在于，所述crRNA 为crRNA-Tg，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
4.基于RPA-CRISPR/Cas12a检测刚地弓形虫试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述上下游引物对、权利要求3所述的crRNA。
5.如权利要求4所述基于RPA-CRISPR/Cas12a检测刚地弓形虫试剂盒，其特征在于，试剂盒为权利要求2所述上下游引物对及RPA扩增体系的TwistAmpTM Basic Kit试剂盒及试剂，权利要求3所述的crRNA及CRISPR/Cas12a荧光检测反应体系的试剂及CRISPR/Cas12a试纸条检测反应体系的试剂。
6.基于RPA-CRISPR/Cas12a检测刚地弓形虫的方法，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.基于rpa-crispr/cas12a检测刚地弓形虫的b1位点的靶点序列，其特征在于，所述靶点序列为刚地弓形虫的b1基因位点mh744807（反向互补链）的第 334 bp～第 357 bp位点的核苷酸序列；所述第 334 bp～第 357 bp位点的核苷酸序列如seq id no：1 所示。
2.基于rpa-crispr/cas12a检测扩增dna的上下游引物对，其特征在于，所述刚地弓形虫的第一组上游引物f104-133的核苷酸序列为seq id no:2、对应下游引物r304-335为seqid no:3、第二组上游引物f101-132的核苷酸序列为seq id no:4、对应下游引物r297-328为seq id no:5、第三组上游引物f105-134的核苷酸序列为seq id no:6、对应下游引物r357-386为seq id no:7、第四组上游引物f91-120的核苷酸序列为seq id no:8、对应下游引物r354-385为seq id no:9、...
【专利技术属性】
技术研发人员：张龙现，王艺林，杨玉荣，毋亚运，李俊强，张恒，秦子扬，赵金凤，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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