本发明专利技术涉及免疫学免疫检测领域。本发明专利技术公开了一种病原相关分子模式免疫检测芯片及其制备方法与应用。该芯片由芯片载体与固定于其上的病原相关分子模式和抗体组成。芯片载体为商品化的晶芯高分子三维基片；本发明专利技术的病原相关分子模式免疫检测芯片，包括病原相关分子模式和抗体微阵列的制备，检测用特异性多克隆抗体的制备和荧光素（Ｃｙ３）标记，及应用该芯片同时检测多个样品与病原相关分子模式相互作用的具体步骤及条件优化。本发明专利技术获得的病原相关分子模式免疫检测芯片可用于免疫识别作用机制的研究，以及药物开发中生物大分子相互作用的研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫学检测技术，具体涉及一种用于检测病原相关分子模 ζ (pathogen-associated molecular pattern, PAMP) % ζ iK 另ll 受{φ (pattern recognition receptor, PRR)相互作用的免疫检测芯片或微阵列、制备方法及其应用，其属 于免疫学、病原微生物学及生物芯片技术交叉领域。
技术介绍
免疫识别是生物机体对外源物质发生免疫应答、实现有效防御的基础，是固有免 疫反应中的关键环节。宿主通过模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)介 导并完成免疫识别作用，其识别的靶分子是与病原微生物致病或生存相关的病原相关分 子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)。 PAMP 主要包括细菌的月旨多 糖(lipopolysaccharides，LPS)、肽聚糖(ρ印tidoglycan，PGN)、脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)、CpG脱氧寡核苷酸(CpG 0DN)，真菌的葡聚糖(glucan)、甘露聚糖(mannan)和 病毒的双链RNA(dsRNA)等。探明PRR与PAMP之间的相互作用是研究免疫识别分子机制的 基础与先决条件，而多数PRR均具有PAMP结合的广谱性，这给研究PRR与PAMP相互作用制 造了难题。鉴于免疫识别过程的重要性和PRR与PAMP结合的广谱性，快速高通量的结合检测 技术已成为各国学者研究的焦点之一。目前，常用检测技术有SDS-PAGE法，生物大分子相 互作用仪检测法，酶联免疫吸附检测法等。基于SDS-PAGE的检测方法直观，但其通量低，且 只适用于不溶性的PAMP ；生物大分子相互作用仪检测法灵敏度高，操作简便，但需配备昂 贵的生物大分子相互作用仪，不易实现；酶联免疫吸附法是目前常用的检测方法，但存在结 果不直观，易产生假阳性的缺点。这些检测技术局限性大，效率低，耗时长，实用性差。因此， 建立一种快速、准确、高通量的PRR与PAMP结合检测技术，已成为免疫识别领域中急需解决 的问题。而新发展起来的生物芯片技术为其提供了强有力的技术平台，多样品检验并行处 理的病原相关分子模式免疫检测芯片，在PRR和PAMP相互作用，及药物开发中生物大分子 相互作用的检测上具有广阔的应用前景。
技术实现思路
针对上述现状，本专利技术的目的是提供一种能同时检测多种PRR与多种PAMP相互作 用的病原相关分子模式免疫检测芯片，用于免疫识别研究中PRR与PAMP相互作用的快速、 准确、高通量的检测。本专利技术的另一个目的是提供上述病原相关分子模式免疫检测芯片的制备方法。本专利技术还有一个目的是提供上述病原相关分子模式免疫检测芯片在PRR与PAMP 相互作用检测中的应用。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的一种病原相关分子模式免疫检测芯片，其结构包括晶芯高分子三维基片、基片上固定有多个6X5的PAMP和抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen 划线隔开。病原相关分子模式免疫检测芯片的制备方法，包括如下步骤(1)抗体的获得及纯化取健康大鼠血清，使用Amersham Phamacia Biotech公司的亲和层析柱(HiTrap Protein G Sepharose Column)纯化大鼠Ig，以大鼠Ig为抗原，常规方法免疫纯种新西兰 白兔，采血制备血清，亲和层析纯化得到兔抗大鼠Ig的抗体。(2) PAMP及抗体样品的准备用pH7. 4的含40%甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解各种PAMP，使脂多糖(LPS)Jt 聚糖(PGN)、酵母葡聚糖(Yeast glucan)、眼虫β_1，3葡聚糖(β-1,3 glucan)、甘露聚糖 (mannan)、脂磷壁酸(LTA) ,Poly I C 浓度为 0. 1 2. Omg/mL, CpG ODN 浓度为 5 25 μ g/ mL ；稀释兔抗大鼠Ig的抗体，使其浓度为0. 05 0. 2mg/mL。(3)样品的点印与固定用点样仪将PAMP溶液和抗体稀释液在琼脂糖凝胶基片的不同区域点样，点样量 为50 70nL，点直径为500 600 μ m。每张芯片两排五列共10个6 X 5亚阵列，每个亚阵 列所点样品一致，一号为LPS，二号为PGN，三号为Yeast glucan，四号为β_1，3 glucan，五 号为marman，六号为LTA，七号为CpG 0DN,八号为PolyI C，九号为质量控制点，所点样品为 兔抗大鼠Ig的抗体作为阳性对照及固定对照，十号为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照。各 个亚阵列之间用芯片专用围栏或Super PAP Pen隔开，形成独立的反应单元。37°C饱和湿 度放置0. 5 2. 5h，60mJ紫外照射10-40min,洗涤，晾干。(4)芯片的封闭向载玻片上点有样品的区域分别滴加3%牛血清白蛋白进行封闭，37°C饱和湿度 放置lh，洗涤，晾干，4°C密封保存，得到病原相关分子模式免疫检测芯片。本专利技术的病原相关分子模式免疫检测芯片的应用，所述该应用的步骤如下(1)用于检测的样品包括重组栉孔扇贝C型凝集素-3 (rCfLec-3)、重组栉 孔扇贝C型凝集素-3-糖识别结构域-1 (rCfLec-3-CRD-l)、重组栉孔扇贝C型凝集 素-3-糖识别结构域_2 (rCfLec-3-CRD-2)、重组栉孔扇贝C型凝集素-3-糖识别结构 域-3 (rCfLec-3-CRD-3)、重组硫氧还蛋白(rTrx)，浓度为 100 μ g/mL ；(2)以rCfLec-3免疫大鼠制备抗体，亲和层析纯化所得抗体；(3)将亲和层析纯化后的大鼠抗rCfLec-3抗体用Cy3标记，过凝胶柱纯化；(4)将待检样品加到上述芯片的5个不同亚阵列中，加样量为20 μ L/阵列，注意避 免不同亚阵列间的液体混合。室温饱和湿度放置1 4h，洗涤，再加稀释的Cy3标记的大鼠 抗rCfLec-3多克隆抗体探针，20 μ L/阵列，37°C饱和湿度放置0. 5 2h，洗涤，晾干。(5)激光扫描上述检测芯片用晶芯 ECoSCanTM-100(XD扫描仪扫描成像，激发波长为532nm，检 测波长为585nm，荧光信号用Lab-chipscanner 2. 0软件分析。检测结果分析与判定扫描得到的图像亚阵列中，十号样品阴性对照的信号强度 代表实验的本底值大小；一号至八号样品出现绿色荧光亮点的为阳性，表明所检测PRR可 与对应的PAMP结合，无绿色荧光亮点的为阴性，表明所检测PRR不能与对应的PAMP结合；九号样品质量控制点出现绿色荧光为正常，如果没有绿色荧光，说明检测操作有问题，检测 结果为无效。所述的 PAMP 为 LPS、PGN> Yeast glucan、β _l，3glucan、mannan、LTA> CpG ODN> Poly I :C八种，但不仅仅限于这八种PAMP。所用于点样的 LPS、PGN、Yeast glucan、β—1，3glucan、mannan、LTA、Poly I:C 最 适浓度为1. Omg/mL，所用于点样的CpG ODN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种病原相关分子模式免疫检测芯片，其特征在于它包括晶芯高分子三维基片，晶芯高分子三维基片上固定有多个病原相关分子模式（ＰＡＭＰ）和抗体微阵列，各个微阵列之间用芯片专用围栏或ＳｕｐｅｒＰＡＰＰｅｎ划线隔开。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，杨嘉龙，邱丽梅，王玲玲，张峘，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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