【技术实现步骤摘要】
本申请属于海洋生物活性物质提取，具体涉及一种抑制血小板凝集的磷虾多肽、制备方法及其应用。
技术介绍
1、南极磷虾主要生活在南极洲周围水域，生物资源量大，含有丰富的营养物质且优质蛋白含量高。目前，开发的应用价值高产品以磷虾油为主，提取磷虾油后的脱脂磷虾粉末得到有效利用，仅用作低附加值的饲料使用。
2、生物活性肽具有各种各样的生理活性，如抗菌抗炎等免疫活性，抑制肿瘤活性，促进生长活性，抗高血压活性，抑制血小板凝集活性等。生物活性肽按照其来源可分为天然生物活性肽和人工水解活性肽。天然生物活性肽主要存在于生物体的各种系统、器官组织及细胞中，如肽类激素，抗生素等。但是，天然活性肽在生物体内含量低，易降解，提取难度大，难以实现规模化、低成本生产。目前，适合规模化生产的水解生物活性肽越来越受到科研工作者的重视。人们已经成功研制了多种生物活性肽：酶解鳕鱼鱼肉得到生长因子促内分泌肽。
3、海洋生物蛋白储量丰富、结构多样、功能独特，是目前开发制备生物活性肽的重要资源。海洋活性肽是海洋生物中氨基酸不同组成和排列方式构成的从简单的二肽到复杂的线性或环状结构的不同肽类的总称，食用安全高，药用功效广，具有广阔的发展前景。海洋活性肽的主要功效包括止痛、免疫调节、抑菌作用、抗血栓作用、降血压和抗凝血等。
4、目前对南极磷虾肽的研究包括：具有抗菌效果的南极磷虾抗菌肽、具有抗氧化活性的南极磷虾多肽、具有抑制血管紧张素（ace）活性的磷虾多肽、具有对非酒精性脂肪肝病保护功效的南极磷虾肽等。但是对具有抑制血小板凝集功效的南极磷虾多肽
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提供了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽及其制备方法，本专利技术制备方法中一次酶解可生成对花生四烯酸诱导的血小板抑制多肽，二次酶解可产生对二磷酸腺苷诱导的多肽，纯化过程可使抑制效果明显增强。制得的磷虾多肽可有效抑制血小板的凝集。
2、本专利技术一方面提供了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
3、s1、先将脱脂南极磷虾粉加入纯化水搅拌均匀，然后加入蛋白酶进行一次酶解，之后灭酶，得到酶解液；
4、s2、将上述酶解液离心取上清液，然后进行过滤、超滤，得到滤出液，之后将滤出液进行浓缩，得到浓缩液；
5、s3、将上述浓缩液作为deae上样液进行离子交换层析，得到洗脱溶液，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品；
6、s4、将上述冻干品加入羧肽酶进行二次酶解，然后超滤除酶、超滤除氟脱盐、冷冻干燥，得到磷虾多肽。
7、可选地，所述步骤s1中一次酶解的过程为：先用摩尔浓度为1mol/l的氢氧化钠调节ph至7.1-8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速600-1000rpm的条件下酶解2-3h，所述蛋白酶为胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，alcalase蛋白酶中的任意一种或几种；灭酶的过程为：用摩尔浓度为1mol/l盐酸调节ph至3.5-4.5，升温至90-100℃后搅拌25-35min实现灭酶。
8、可选地，所述步骤s2中离心的过程为：待所述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/l氢氧化钠调节ph至10-10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。
9、可选地，所述步骤s2中过滤前用摩尔浓度为1mol/l盐酸调节ph至7.0-7.5，然后经滤布过滤得到过滤液。
10、可选地，所述过滤液采用20-50kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/l的tris-盐酸溶液、ph 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度低于0.05时结束超滤，收集滤出液。
11、可选地，所述滤出液经1-5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
12、可选地，所述步骤s3中离子交换层析的层析介质为deae sephadex a-50，平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/l的tris-盐酸溶液；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/l的tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/l的氯化钠溶液；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/l的tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/l的氯化钠溶液。
13、可选地，所述步骤s4中二次酶解前加入摩尔浓度为0.05mol/l的碳酸铵溶液，调节ph为8.0-8.5，然后加入0.2-0.5g羧肽酶a，在35-40℃的水浴锅中二次酶解20-40min，之后用15-40kd的超滤膜超滤，分多次加入摩尔浓度为0.5mol/l的氯化钠溶液，收集滤出溶液，再用1-5kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽。
14、本专利技术另一方面提供了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，所述抑制血小板凝集的磷虾多肽采用上述的制备方法制得。
15、本专利技术又一方面提供了一种如上述所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽在制备食品、保健品中的应用。
16、本申请的有益效果包括但不限于：
17、1、本专利技术提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法中，一次酶解可生成对花生四烯酸诱导的血小板抑制多肽，二次酶解可产生对二磷酸腺苷诱导的多肽，纯化过程可使抑制效果明显增强；
18、2、本专利技术提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法中，超滤和离子交换层析过程能够降低氟含量，制备脱氟磷虾多肽；
19、3、本专利技术提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，一次酶解后，采用超滤和deae阴离子层析，再用羧肽酶酶解，能够降低羧肽酶的使用量，节约成本并且后续工艺中容易去除；
20、4、本专利技术提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，在制备过程不使用挥发性有机溶剂，降低了安全风险；
21、5、本专利技术提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，采用了蛋白酶和羧肽酶复合酶解技术，与之前单一蛋白酶酶解技术相比，能够开发出潜在的新功效，为磷虾多肽的研究开辟了新的方向。
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1.一种抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中一次酶解的过程为：先用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.1-8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速600-1000rpm的条件下酶解2-3h，所述蛋白酶为胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，Alcalase蛋白酶中的任意一种或几种；灭酶的过程为：用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至3.5-4.5，升温至90-100℃后搅拌25-35min实现灭酶。
3.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中离心的过程为：待所述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10-10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。
4.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中过滤前用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.0-7.5，然后经滤布过滤得到过滤液。
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6.根据权利要求5所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述滤出液经1-5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
7.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中离子交换层析的层析介质为DEAE Sephadex A-50，平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液。
8.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中二次酶解前加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0-8.5，然后加入0.2-0.5g羧肽酶A，在35-40℃的水浴锅中二次酶解20-40min，之后用15-40kd的超滤膜超滤，分多次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，收集滤出溶液，再用1-5kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽。
9.一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，其特征在于，所述抑制血小板凝集的磷虾多肽采用如权利要求1~8任意一项所述的制备方法制得。
10.一种如权利要求9所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽在制备食品、保健品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中一次酶解的过程为：先用摩尔浓度为1mol/l的氢氧化钠调节ph至7.1-8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速600-1000rpm的条件下酶解2-3h，所述蛋白酶为胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，alcalase蛋白酶中的任意一种或几种；灭酶的过程为：用摩尔浓度为1mol/l盐酸调节ph至3.5-4.5，升温至90-100℃后搅拌25-35min实现灭酶。
3.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中离心的过程为：待所述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/l氢氧化钠调节ph至10-10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。
4.根据权利要求1所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤s2中过滤前用摩尔浓度为1mol/l盐酸调节ph至7.0-7.5，然后经滤布过滤得到过滤液。
5.根据权利要求4所述的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述过滤液采用20-50kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/l的tris-盐酸溶液、ph 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度低于0.05时结束超滤，收集滤出液。
【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，高以成，周芳，
申请(专利权)人：逢时青岛海洋科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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