【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种生物细胞培养技术，具体来说是一种宫颈癌血管化类器官的制备方法。
技术介绍
1、宫颈癌（cervical cancer，cc）是最常见的妇科肿瘤之一，也是女性癌症相关死亡的第四大原因。全球报告了约604,127例cc新病例和341,831例cc相关死亡。在局部晚期宫颈癌的治疗中，盆腔放疗联合化疗已成为标准治疗方法，随机临床试验显示有效率约为90%，平均5年生存率为72%。然而，约20%的宫颈癌患者在放化疗后的5年内出现盆腔复发和/或远处转移，这通常导致死亡。由于晚期疾病的治愈率较低，宫颈癌患者迫切需要新的治疗选择。
2、近年来，宫颈癌新型靶向药物的研究为宫颈癌治疗带来了新的希望，大量新兴药物的涌现对药物效能检测手段提出了更高的要求。为了进一步提高药物筛选流程的程序化和标准化水平，提高检测的准确度和通量，提高宫颈癌靶向药物治疗效果，亟需开发可更好模拟宫颈癌微环境及更精细化的药物筛选模型和可规模化生产的药物筛选检测系统。
3、血管生成在宫颈癌的发展过程中起着重要作用，它为肿瘤提供了充足的氧气和营养物质，并提供了转移途径。因此，与传统的类器官培养相比，构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类器官可减少营养供给缺乏导致的较大差异，对于深入理解宫颈癌的发展机制、寻找宫颈癌治疗的靶向药物以及开发个体化治疗方案具有重要意义。
4、血管化类器官是由宫颈癌类器官和caf-huvec球组成的三维结构。与传统的不含血管结构的类器官相比，其通过模拟人体血管系统的结构，不仅为肿瘤细胞提供了良好的
5、此外，血管化类器官能够促进组织的成熟和稳定，包括细胞的排列、器官的结构和功能的完善，以及细胞信号传导的正常调节等方面。基于血管化类器官能够更真实地模拟人体器官的生理条件，可以更准确地评估药物的疗效和安全性，有助于提高药物筛选的效率，减少无效药物的开发和不必要的临床试验。
6、综上，利用宫颈癌组织构建宫颈癌血管化类器官模型，可以更好地模拟宫颈癌在体内的生长和转移过程，揭示了肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的相互作用以及血管生成的机制。这种方法可以加速药物筛选和个体化治疗策略的开发，促进个性化医学的发展，也可进一步深入研究宫颈癌肿瘤微环境中细胞增殖、血管生成、恶性进展的分子机制，更好地理解宫颈癌的发展，并为药物筛选和治疗提供更可靠的依据。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，所述的这种宫颈癌血管化类器官的制备方法要解决现有技术中缺乏构建血管微环境的宫颈癌类器官的技术问题。
2、本专利技术提供了一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，包括以下步骤：
3、（1）一个构建宫颈癌类器官的步骤；
4、（2）一个构建caf-huvec球的步骤；
5、（3）一个构建宫颈癌血管化类器官的步骤。
6、进一步的，在步骤（1）中，将宫颈癌组织标本置于预冷的advanced dmem/f12培养基（中国上海，赛默飞12634010）中，然后用剪刀剪碎宫颈癌组织，然后放置于胶原酶i溶液中消化，在37°c的摇床上振荡后继续用玻璃吸管对悬浮液进行机械剪切；通过70μm尼龙细胞滤网过滤细胞，1000~1500 rpm离心收集细胞并用类器官培养基洗涤；再采用红细胞裂解液裂解后用类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液加入已提前预热的基底膜提取物的培养板中，去除未贴壁细胞，即得到宫颈癌类器官。
7、进一步的，在步骤（2）中，将2~5mg/ml的胶原蛋白i溶液加入falcon管中，再添加在冰上解冻的基质胶；在24细胞培养板中添加胶原蛋白i-基质胶溶液，旋转均匀后在37℃培养使其凝固，放置从宫颈癌组织中提取的肿瘤相关成纤维细胞与人脐静脉内皮细胞混合细胞，细胞数为1:1，加入stempro-34 sfm完全培养基培养以构建caf-huvec球。
8、进一步的，在步骤（3）中，在8~12mg/ml胶原蛋白i溶液中加入宫颈癌类器官与caf-huvec球并将混合体系移入ep管中；宫颈癌类器官与caf-huvec球的个数比为1:1，添加stempro-34 sfm完全培养基清洗；吸取培养基，将宫颈癌类器官与caf-huvec球混合体系悬浮于胶原蛋白i-基质胶溶液中，放于冰上；在细胞培养板中添加胶原蛋白i-基质胶溶液，均匀旋转板后将板在37℃下孵育以使其凝固，取出带有胶原蛋白i-基质胶的细胞培养板，然后将宫颈癌类器官-caf-huvec球-胶原蛋白i-基质胶溶液加入细胞培养板中；摇动板使混合体系均匀分布在孔中，在37℃培养使凝胶固化；添加预热stempro-34 sfm完全培养基诱导血管分化；3天后更换培养基，之后每隔一天更换一次培养基，得到宫颈癌血管化类器官。
9、本专利技术提供了一种制备宫颈癌血管化类器官的方法，可以将本专利技术的模型用于基础研究中。构建的宫颈癌血管化类器官，可以促进血管生成机制、疾病进展机制和药物治疗响应的进一步研究，同时减少对动物实验的依赖，为疾病治疗和新药开发提供更可靠的工具和方法。。
10、在其中一些实施例中，所述的宫颈癌血管化类器官模型用于基础研究，其步骤包括：利用等比例的宫颈癌类器官和caf-huvec球混合培养，构建宫颈癌血管化类器官，用于评估新的治疗方法和药物的疗效。
11、在其中一些实施例中，所述基质胶为matrigeltm，stempro-34 sfm完全培养基为含有体积百分比浓度为15% 的fbs、100ng/ml vegf-a、100ng/ml fgf-2和50ng/ml bmp4的stempro-34 sfm培养基（中国上海，赛默飞10639011）。
12、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
13、（1）本专利技术利用离体的宫颈癌组织构建宫颈癌类器官，由于离体组织含有丰富的上皮组织样本，因此更容易培养出具有较高活性的类器官。
14、（2）本专利技术采用肿瘤成纤维细胞和人静脉内皮细胞构建血管网络，操作简便，无需复杂仪器，易于推广。
15、（3）本专利技术构建的宫颈癌血管化类器官模型，将宫颈癌类器官与caf-huvec球等比例混合包埋至基质胶中，实现了宫颈癌细胞与huvec之间直接和间接的相互作用；相比起传统2d层面的小管形成实验，huvec可形成稳定管腔，培养周期长且可实现长期观察；与现有的3d培养单细胞球表型研究相比，加入了huvec共培养模拟微环境细胞间互作，使模型更大程度上还原了真实的宫颈癌肿瘤微环境，有利于宫颈癌血管生成的机制研究，为推动药物研发和个性化医学的发展提供了一种易操作、可推广的模型，更好地满足了科研和临床应用的需求。
16、本专利技术通过利用宫颈癌组织构建的类器官与由患者来源的肿瘤相关成纤维细胞（caf）和人静脉内皮细胞（h本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，将宫颈癌组织标本置于预冷的DMEM/F12培养基中，然后用剪刀剪碎宫颈癌组织，然后放置于胶原酶I溶液中消化，在37°C的摇床上振荡后继续用玻璃吸管对悬浮液进行机械剪切；通过70μm尼龙细胞滤网过滤细胞，1000~1500 rpm离心收集细胞并用类器官培养基洗涤；再采用红细胞裂解液裂解后用类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液加入已提前预热的基底膜提取物的培养板中，去除未贴壁细胞，即得到宫颈癌类器官。
3.根据权利要求1所述的一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，将2~5mg/ml的胶原蛋白I溶液加入Falcon管中，再添加在冰上解冻的基质胶；在细胞培养板中添加胶原蛋白I-基质胶溶液，旋转均匀后在37℃培养使其凝固，放置从宫颈癌组织中提取的肿瘤相关成纤维细胞与人脐静脉内皮细胞混合细胞，细胞数为1:1，加入StemPro-34 SFM完全培养基培养以构建CAF-HUVEC球。
4.根
...【技术特征摘要】
1.一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，将宫颈癌组织标本置于预冷的dmem/f12培养基中，然后用剪刀剪碎宫颈癌组织，然后放置于胶原酶i溶液中消化，在37°c的摇床上振荡后继续用玻璃吸管对悬浮液进行机械剪切；通过70μm尼龙细胞滤网过滤细胞，1000~1500 rpm离心收集细胞并用类器官培养基洗涤；再采用红细胞裂解液裂解后用类器官培养基重悬细胞，将细胞悬液加入已提前预热的基底膜提取物的培养板中，去除未贴壁细胞，即得到宫颈癌类器官。
3.根据权利要求1所述的一种宫颈癌血管化类器官的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，将2~5mg/ml的胶原蛋白i溶液加入falcon管中，再添加在冰上解冻的基质胶；在细胞培养板中添加胶原蛋白i-基质胶溶液，旋转均匀后在37℃培养使其凝固，放置从宫颈癌组织中提取的肿瘤相关成纤维细胞与人脐静脉内皮细胞混合细...
【专利技术属性】
技术研发人员：邱君君，华克勤，姜绮安，王丽，王珏，陈芳华，任庭婷，
申请(专利权)人：复旦大学附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。