【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物学和分子生物学领域，具体涉及一种构建耐酸性工程藻的方法。
技术介绍
1、微藻作为可进行光合作用的单细胞微生物，其生物质生产效率和固碳效率远远超过陆生植物。生产微藻被认为是一种高效减少二氧化碳排放的途径，同时可转化为高附加值产品，因此，生产微藻的方法得到广泛关注。目前的主要研究方向是将微藻生产和废气废水处理结合，从而在减少二氧化碳排放和净化废水的同时产生经济效益。但是这种生产策略的技术瓶颈在于温室气体造成的酸性环境会阻碍微藻的生长，导致产量低下。因此需要改良藻种以提高微藻在酸性环境中的产量。
2、主要的微生物育种改良方法包括随机诱变，适应性实验室进化和基因工程。适应性实验室进化(adaptive laboratory evolution,ale)利用人工控制的胁迫环境筛选有益的自发突变，从而在种群中积累更能克服压力环境的变种。这种方法简单有效，可以系统性优化微生物在压力环境中的适应度，从而提升不利条件中的生物质产量。基于筛选种群中自发的有益随机突变这一原理，ale可以培育抗逆性强的藻种。但是，不同种群理论上可能有不同的进化途径。如果单一恒定的选择压力导致具有类似抗逆表型的变种在不同的种群被筛选出来，那么不同种群中出现的相同的基因突变和差异调控更有可能对它们类似的表现型产生作用。我们用转录组揭示不同种群中相同的基因调控来指导基因工程改造。
3、三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum)是一种海洋硅藻。它生长快速，富含高价值生物活性成分，包括不饱和脂肪酸(如epa)和类胡
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决工业生产中硅藻生长受酸性环境抑制的问题，并提供一种构建耐酸性工程藻的方法。根据本方法，通过适应性进化可获得耐酸性的驯化种，通过基因工程构建耐酸性的工程藻种。
2、本专利技术所采用的具体技术方案如下：
3、本专利技术提供一种构建耐酸性工程藻的方法，具体步骤如下：
4、s1：将注释功能和离子通道、ph内稳态有关的基因作为目的基因；去除所述目的基因的终止密码子，并通过编码甘氨酸的dna序列连接去除起始密码子的荧光蛋白基因，得到重组基因；所述目的基因为序列结构如seq id no.1所示的phatr3_j33543、序列结构如seqid no.2所示的phatr3_j50516或序列结构如seq id no.3所示phatr3_jdraft1806；
5、s2：将所述重组基因插入具有抵抗抗生素基因的pphanr质粒的多克隆位点中，得到载体质粒；
6、s3：将所述载体质粒和鲑鱼精子dna溶液混合，得到混合液；将所述混合液冰浴后，通过电穿孔导入已完成除盐预处理的硅藻细胞中，随后将硅藻细胞置于暗处，进行第一次培养；将第一次培养后的硅藻细胞接种至含博来霉素的esaw固体培养基上，进行第二次培养，直至所述固体培养基上生长出现藻落；
7、s4：挑选步骤s3得到的藻落中具有荧光蛋白信号的藻落，即为耐酸性的工程藻。
8、作为优选，步骤s2中的pphanr质粒含有抗博来霉素抗性基因(zeor/bleor)；插入的重组基因位于内源硝酸还原酶启动子和终止子之间，其基因表达受硝酸还原酶启动子(pnr)调控。
9、作为优选，步骤s2中所述的载体质粒通过导入大肠杆菌的方式进行扩增。
10、作为优选，步骤s3中所述的电穿孔导入采用电穿孔仪，设置参数如下：场强为0.5kv，电容为25μf，电阻为400 ohm。
11、作为优选，步骤s3中所述的混合液中载体质粒和鲑鱼精子dna的质量比为1：10。
12、作为优选，步骤s3中所述的硅藻细胞为野生型三角褐指藻(phaeodactylumtricornutum)细胞。
13、作为优选，步骤s3所述除盐预处理步骤如下：离心收集处于对数生长期的三角褐指藻细胞后，通过反复离心重悬，将沉淀的三角褐指藻细胞用山梨醇溶液洗涤除盐后重悬于山梨醇溶液中。
14、进一步的，上述山梨醇溶液的浓度为375 mm。
15、作为优选，上述第一次培养在暗处培养24 h，第二次培养进行2～3周。
16、作为优选，步骤s3中所述的esaw固体选择培养基中博来霉素的浓度为100μg/l。
17、作为优选，步骤s4中荧光蛋白信号的强度为野生型藻细胞内绿色荧光的6～10倍。
18、本专利技术相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
19、本专利技术提供了一种构建耐酸性工程藻的方法，能够增强海洋硅藻的耐酸性，使构建的工程藻在低ph压力环境中的生长提高。本专利技术通过在野生型三角褐指藻中分别插入三种目的基因构建工程藻，经过实验可得，三组工程藻对酸性刺激的耐受均显著提高，工程藻的最大生长速率是野生型的1.7到1.8倍。该方法对耐酸性硅藻培育具有重要借鉴意义。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S2中所述的pPhaNR质粒含有抗博来霉素抗性基因ZeoR/bleoR；插入的重组基因位于内源硝酸还原酶启动子和终止子之间，其基因表达受硝酸还原酶启动子pNR调控。
3.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的电穿孔导入采用电穿孔仪，设置参数如下：场强为0.5kV，电容为25μF，电阻为400Ohm。
4.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的混合液中载体质粒和鲑鱼精子DNA的质量比为1：10。
5.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的硅藻细胞为野生型三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)细胞。
6.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3所述除盐预处理步骤如下：离心收集处于对数生长期的三角褐指藻细胞后，通过反复离心重悬，将沉淀的三角褐指藻细胞用山梨
7.根据权利要求6所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，所述山梨醇溶液的浓度为375mM。
8.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，所述第一次培养在暗处培养24h；所述第二次培养进行2～3周。
9.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S3中所述的ESAW固体选择培养基中博来霉素的浓度为100μg/L。
10.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤S4中荧光蛋白信号的强度为野生型藻细胞内绿色荧光的6～10倍。
...【技术特征摘要】
1.一种构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤s2中所述的pphanr质粒含有抗博来霉素抗性基因zeor/bleor；插入的重组基因位于内源硝酸还原酶启动子和终止子之间，其基因表达受硝酸还原酶启动子pnr调控。
3.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤s3中所述的电穿孔导入采用电穿孔仪，设置参数如下：场强为0.5kv，电容为25μf，电阻为400ohm。
4.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤s3中所述的混合液中载体质粒和鲑鱼精子dna的质量比为1：10。
5.根据权利要求1所述的构建耐酸性工程藻的方法，其特征在于，步骤s3中所述的硅藻细胞为野生型三角褐指藻(phaeodactylum trico...
【专利技术属性】
技术研发人员：傅维琦，苏奕熹，胡婧妍，舒玥璇，陈季威，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。