本发明专利技术涉及一种蛋白定向进化领域中对水溶性／折叠强的蛋白突变体进行筛选的一种高通量、灵敏度高、方便筛选的Ｔ载体及其构建方法和应用，本发明专利技术的Ｔ载体为在出发载体ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ中引入６个组氨酸（Ｈｉｓ）标签、多克隆位点序列（ＭＣＳ）和编码红色荧光蛋白ＵＰＭＴ的ｃｏｂＡ基因序列。本发明专利技术所构建的用于筛选蛋白可溶性表达的Ｔ载体，带有强的Ｐｔａｃ启动子，可以对ＰＣＲ产物直接用于克隆、表达、纯化；特别地，可以对水溶性强／超折叠的蛋白突变体进行方便地筛选。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种用于高通量筛选蛋白可溶性表达的T载 体及其构建方法，还涉及该T载体在基因工程中的应用。
技术介绍
PCR(Polymerase chain reaction)是分子生物学和基因工程研究领域中的常规 实验技术，是目前基因克隆，基因或DNA片段研究的必经之路。克隆PCR产物最直接、最方便 的方法是T/A克隆。所谓T/A克隆就是将;T端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到;T端具 有单个T尾巴的T载体上。在PCR扩增过程中，由于Taq酶具有不依赖于模板的末端转移酶 活性而在PCR产物的3、端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的腺嘌呤 脱氧核苷酸(A)，从而便得50%以上的PCR产物的3、末端具有单个腺嘌呤脱氧核苷酸，即 3、端 A尾巴(Clark JM. Novel non-templated nucleotide additonreactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNApolymerases. Nucleic Acids Res. 1988，16(20) 9677-9686 ；Schutte BC, Ranade K，Pruessner J，Dracopoli N. Optimizedconditions for cloning PCR products into an XcmI T-vector. BioTechnique. 1997,22(1) :40_42 ; Ichihara YiKurosawa Y. Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993，130 (1) : 153—154.)。因此，幵发出一种3、末端带一突出“Τ”的特殊载体——T载体，用于克隆Taq酶 扩增的PCR产物，以克服传统克隆技术载体容易自连，克隆效率低，筛选阳性克隆难度大， 实验费用高等缺点。根据构建策略的不同，T载体制备方法有3种方法一是利用产生平 末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷 酸(ddTTP)添加到线状载体的 3、末端(Holton TA，Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR productsusing ddT—tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991,19(5) :1156.)。方法二是利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性，在不 存在脱氧腺嘌呤核苷酸(dATP)的情况下有相对良好的;T末端加“T”的能力，将单个脱氧 胸腺核苷酸(dTTP)添加到线状载体的端(Marchuk D，Drumm M，Saulino A，Collins FS.Construction ofT-vectors, a rapid and general system for direct cloning ofunmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991，19 (5) :1154·)。方法三是在质粒 载体的多克隆位点引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生;T具有单个T突出的 线性T载体。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括Xcm I、Ahd I /Eami 105 I / EclHK I /AspE I NruG I /BspOVKBfi I /Bmr I、Hph I /AsuHP I、Mbo II /Ncu I、 Bfu I /Bci VI、HpyA V /Hin4 II等。其中Xcm I和Ahd I及其同裂酶在制备T载体中广 泛应用。其它内切酶不是因为太昂贵，就是因为在普通克隆载体上有太多的识别位点，因而 在制备T载体的应用中受到限制。目前常用的T载体大多为商品化的载体，这些T载体基本上可以满足PCR产物克 隆的要求，但要进行蛋白表达、纯化以及对蛋白突变体进行筛选还需要寻找更有利的载体。 在大肠杆菌系统中，异源蛋白重组表达最大瓶颈之一是过量表达的目标蛋白由 于低的水溶性或不正确的折叠，导致形成没有任何生物学活性的包涵体。蛋白定向进化 是克服这一难题使目标蛋白以水溶态形式表达的有力而有效的工具(Wigley WC, et al, Proteinsolubility and folding monitored in vivo by structuralcomplementation of a genetic marker protein. Nat Biotechno1. 2001，19(2) : 131-136 ；Yang JK， Park MS，Waldo GS, Suh SW. Directedevolution approach to a structural genomics project :Rv2002from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003， 100(2) 455-460 ；Pedelacq JD, Piltch E， Liong EC， BerendzenJ, Kim CY， Rho BS， Park MS，Terwilliger TC, Waldo GS. Engineering soluble proteins for structural genomics. NatBiotechnol. 2002, 20(9) :927_932 ；Esteban 0，Zhao H. Directedevolution of soluble single-chain human class IIMHC molecules. J Mol Biol. 2004，340 (1) 81-95.)。定向进化技术早已应用在改善酶的专一性、热稳定性和结合其它蛋白的亲和 性。近年来，此技术在结构生物中的应用日益受到重视。许多成功的例子表明该技术可 以用于改善蛋白的水溶性，效果显著，其中一些蛋白的晶体结构还得到解(Kaur J，et al, Directed evolution :an approach to engineerenzymes. Crit Rev Biotechnol. 2006， 26(3) 165-199 ；Hart DJ, Tarendeau F.Combinatorial library approaches for improvingsoluble protein expression in Escherichia coli.ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.2006,62(1) 19-26 ；RoodveldtC，et al, Directed evolution of proteins for heterologousexpression and stability. Curr Opin Struct Biol.2005, 15(1) :50本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于筛选蛋白可溶性表达的Ｔ载体，其特征在于在出发载体ｐＭＡＬ－ｃ２ｘ中引入６个组氨酸（Ｈｉｓ）标签、多克隆位点序列（ＭＣＳ）和编码红色荧光蛋白ＵＰＭＴ的ｃｏｂＡ基因序列，其中多克隆位点序列与ｃｏｂＡ基因融合，所述多克隆位点序列中含有两个隐藏有３｀突出Ｔ末端的Ｅａｍ１１０５Ⅰ酶切位点，用Ｅａｍ１１０５Ⅰ酶切，切胶纯化可以方便的得到成熟的Ｔ载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范军，张宽亮，魏玲玲，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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