【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒及鉴定小鼠源细胞系的方法。
技术介绍
1、细胞系作为生命科学、生物医学等众多领域研究的常用材料，具有举足轻重的作用，它是开展体外实验的重要来源。细胞系常见的质量问题包括细胞老化、细胞性质改变、细胞污染等，常见的细胞污染包括细菌/真菌污染、支原体感染、细胞间交叉污染。根据文献及atcc权威数据，细胞库存在不同程度的交叉污染：德国细胞库中，252 株新建系细胞有18%存在交叉污染现象，人肿瘤细胞系的交叉污染高达 29%，伊朗的细胞库中 18. 8％的细胞株存在交叉污染现象。部分科研论文因为细胞系的错误使用而撤稿，造成了巨大的经济损失及时间人力成本的浪费。细胞交叉污染难以通过形态检测法发现，常用的检测方法包括同工酶谱检测法、染色体核型检测法、hla基因型检测法，str基因分型检测法，snp检测法，流式检测法和免疫荧光染色检测法等，其中str基因分型检测法为应用最为广泛的方法。
2、str是存在于基因组dna中的一类具有长度多态性的dna序列，由2-6个碱基的重复单位串联构成，可作为高度多态性标记，也被称为细胞的dna指纹。tautz d等和edwards a等利用str分型技术对28个研究单位的278株人源细胞系进行交叉污染检测和身份鉴定，发现其中46%的细胞存在交叉污染，交叉污染的细胞中40%来自中国，67%的细胞污染源是hela细胞及其与其他细胞相互杂交的亚细胞株（simple sequences. curr opin genet dev.1994; 4:
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括能同时扩增9个小鼠str位点的引物对；所述9个小鼠str位点为：4-2、5-5、12-1、x-1、18-3、6-4、6-7、9-2、15-3；
2、所述引物对由如下核苷酸序列组成：
3、扩增4-2的引物对seq id no：1~2；
4、扩增5-5的引物对seq id no：3~4；
5、扩增12-1的引物对seq id no：5 ~6；
6、扩增x-1的引物对seq id no:7 ~8；
7、扩增18-3的引物对seq id no：9 ~10；
8、扩增6-4的引物对seq id no：11~12；
9、扩增6-7的引物对seq id no:13~14；
10、扩增9-2的引物对seq id no:15~16；
11、扩增15-3的引物对seq id no:17~18。
12、进一步地，所述试剂盒还包括能同时扩增人源基因d5s818的引物对；所述引物对的核苷酸序列如seq id no:19 ~20所示。
13、进一步地，所述试剂盒还包括能标记扩增片段的荧光引物；所述试剂盒还包括能标记扩增片段的荧光引物对；所述荧光引物对由核苷酸序列如seq id no:21所示的fam-f，seqid no:22所示的rox-f和seq id no:23所示的str-r组成。
14、进一步地，所述试剂盒还包括pcr扩增缓冲液、dntp 、taq酶、甜茶碱。
15、更进一步地，所述taq酶为takara r007酶。
16、本专利技术还提供了一种鉴定小鼠源细胞系的方法，它包括如下步骤：
17、（1）提取待检细胞样本的基因组总dna，作为模板dna；
18、（2）使用前述小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒对模板dna进行pcr扩增，得扩增产物；
19、（3）扩增产物在基因测序仪上进行荧光检测，根据检测到的数据确定待检细胞中dna的str位点的等位基因号，通过等位基因号确定细胞是否为小鼠源细胞系。
20、进一步地，步骤（1）所述模板dna浓度10ng/µl。
21、进一步地，步骤（2）所述pcr扩增分两轮进行，第一轮pcr扩增的体系组成为：
22、
23、所述多重引物mix是浓度10μm的如下各引物对按体积比混合，再与ddh2o按体积比9:1混合而成：
24、
25、所述各引物对中的上下游引物等体积。
26、第二轮pcr扩增的体系组成为：
27、
28、所述荧光引物mix是浓度100μm的如下各引物按体积比混合，再与ddh2o按体积比4:96混合而成：
29、。
30、更进一步地，所述第一轮pcr扩增时的程序为：
31、
32、所述第二轮pcr扩增时的程序为：
33、。
34、本专利技术有益效果：
35、本专利技术小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，通过特定的引物，将原本需要10对荧光引物缩减为2对，大大降低了检测成本；通过使用本专利技术试剂盒建立的小鼠源细胞系的鉴定方法，在特定的引物配比、两轮多重pcr的配合下，可同时扩增引入的人源细胞系特异基因，达到验证小鼠来源细胞系中是否存在人源细胞系的污染，可解决实验室常用种属细胞系（人源及小鼠源）交叉污染的问题。经试验证明：使用本专利技术鉴定方法能确定至少15种常用小鼠细胞系的类型，并判断是否存在人源细胞污染，结果准确可靠。
36、显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
37、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
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1.一种小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括能同时扩增9个小鼠STR位点的引物对；所述9个小鼠STR位点为：4-2、5-5、12-1、X-1、18-3、6-4、6-7、9-2、15-3；
2.根据权利要求1所述的小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括能同时扩增人源基因D5S818的引物对；所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO:19 ~20所示。
3.根据权利要求1所述的小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括能标记扩增片段的荧光引物对；所述荧光引物对由核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示的FAM-F，SEQ ID NO:22所示的ROX-F和SEQ ID NO:23所示的STR-R组成。
4.根据权利要求1所述的小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增缓冲液、dNTP 、Taq酶、甜茶碱。
5.根据权利要求4所述的小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述Taq酶为Takara R007酶。>
6.一种鉴定小鼠源细胞系的方法，其特征在于：包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述模板DNA浓度10ng/µL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述PCR扩增分两轮进行，第一轮PCR扩增的体系组成为：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述第一轮PCR扩增时的程序为：
...【技术特征摘要】
1.一种小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括能同时扩增9个小鼠str位点的引物对；所述9个小鼠str位点为：4-2、5-5、12-1、x-1、18-3、6-4、6-7、9-2、15-3；
2.根据权利要求1所述的小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括能同时扩增人源基因d5s818的引物对；所述引物对的核苷酸序列如seq idno:19 ~20所示。
3.根据权利要求1所述的小鼠短串联重复序列多重扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括能标记扩增片段的荧光引物对；所述荧光引物对由核苷酸序列如seq id no:21所示的fam-f，seq id no:22所示的rox-f和seq id no:23...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴思思，方莅媛，陈雪梅，皮晋魁，张艳净，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：
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