【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及农业种植，尤其涉及一种外生菌根真菌云南硬皮马勃zss01及其应用。
技术介绍
1、外生菌根(ectomycorrhiza, ecm)在森林生态系统中具有举足轻重的作用。外生菌根真菌和树木在长期的共同进化过程中，形成共生关系，帮助宿主植物扩大根部的吸收面积，提高对水分和矿物质的吸收，同时菌根还能提高土壤的生物活性，改良土壤的理化性质，进而增强宿主植物的抗氧化性、抗逆性和抗病性，提高造林成活率，促进林木茁壮成长，对林业的发展起着十分重要的作用。
2、松树是北半球温带森林的主要建群树种，也是我国重要的造林和用材树种。其中，作为我国西南特别是云南境内主要的建群树种云南松和思茅松，在造林过程中，存在幼苗成活率、人工林的品质、树林的稳定性低等问题，云南硬皮马勃( scleroderma yunnanense)作为国内唯一可食用的硬皮马勃种，生长于针叶林和混交林内，是硬皮马勃属中的一个特有种。虽然现有技术cn201410425245.9中公开了用获得的硬皮马勃孢子接种宿主后，获得了较高侵染率的菌根苗，但是该专利存在以下问题，首先，并未交代具体是哪个硬皮马勃的种，硬皮马勃属（ scleroderma）共25个种，分布在世界各地，从北到南森林、公园和农地均有分布，种类繁多包括大孢硬皮马勃、光硬皮马勃、多根硬皮马勃等，不同种硬皮马勃作为ecm的效果无法预期；其次，孢子接种虽然接种周期短、成本低，但野外采集的硬皮马勃成熟度、孢子活性等难以保障，接种成功率的稳定性不高；最
技术实现思路
1、本专利技术的目的在提供一种外生菌根真菌原种的制备方法及其应用，以提高幼苗成活率，提高人工林的品质，增强树林的稳定性着手，达到增加木材储量、发挥生态效益、创建优美环境。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、云南硬皮马勃zss01菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏编号为 cctcc no:m 2023594，保藏日期为2023年4月23日，分类命名为scleroderma yunnanense zss01。
4、一种菌剂，含有云南硬皮马勃zss01菌株培养后获得的菌丝体发酵液。
5、进一步的，本专利技术提供了菌剂制备方法，包括以下步骤：
6、（1）制备液体种子：将云南硬皮马勃zss01菌株在无菌环境条件下转接到改良pda固体培养基上，在25℃培养箱内培养活化，用打孔器在活化的菌落上打孔，转至灭菌后的改良pda液体培养基内，25℃条件培养20 d，得到菌丝体种子，备用；
7、（2）制备菌丝体：取步骤（1）制备的菌丝体种子在无菌环境下接种到改良pda液体培养基中，扩大培养，获得菌丝体发酵液并收集。
8、进一步的，所述改良pda固体培养基配方为：马铃薯200g，琼脂18.0 g，葡萄糖20.0g，kh2po43.0 g，mgso4·7h2o 1.5 g，维生素b1 10 mg，nh4no3 0.25 g，ph5.7±0.1，蒸馏水1000 ml，应当能理解的是，改良pda液体培养基的配置即在改良pda固体培养基基础上去除琼脂18.0 g即可。
9、进一步的，扩大培养的条件如下：培养温度25℃，ph 5.7±0.1，150 r·min-1摇床培养14 d。
10、本专利技术还提供了一种菌丝体胶丸，所述菌丝体胶丸含有云南硬皮马勃zss01菌株的菌丝体。
11、进一步的，菌丝体胶丸的制备方法，包括以下步骤：
12、s1：将制备获得的菌丝体发酵液，无菌条件下过滤，获得菌丝体，将菌丝体无菌条件下粉碎，悬浮在吐温-80溶液中，备用；
13、s2：将s1所得悬浊液加到灭菌后的海藻酸钠溶液中，备用；
14、s3：将s2所得溶液加入灭菌后的cacl2溶液中，缓慢搅拌，固化25 min后形成菌丝体胶丸；
15、s4：将s3中获得的菌丝体胶丸捞出，保存在4℃无菌水中，备用。
16、优选的，海藻酸钠溶液浓度为2%~4%，悬浊液和海藻酸钠溶液的体积比为1:50，cacl2溶液的浓度为0.15~0.25 mol/l。
17、进一步的，本专利技术还提供了一种外生菌根真菌三级原种的制备方法，包括以下步骤
18、s1：将菌丝体胶丸在无菌环境条件下接种到装有改良pda固体培养基的三角瓶1/3处，25℃下培养至菌丝体胶丸上的菌丝长满整个三角瓶培养基表面；
19、s2：往三角瓶内装入按照体积比1:4混合灭菌后的麦麸和针叶树木屑，至2/3处，25℃下培养至菌丝长满整个三角瓶。
20、可选的，在实际应用过程中，本专利技术所提供的云南硬皮马勃zss01菌株，以及由包含该菌株或者由该菌株制备的菌剂、菌丝体胶丸、外生菌根真菌三级原种，均可以直接或者间接的接种至松树苗木形成外生菌根，优选的，所述松树为云南松或思茅松。
21、本专利技术具有以下有益效果：
22、首先，本专利技术对通过组织分离获取纯培养的菌株进行了保藏（cctcc no:m2023594），保证侵染根系的为单一菌种且成功率高，可进行大量生产，进而获得高质量的菌根苗，比孢子侵染根系更有效，侵染率达到90%以上，更容易获得高质量的菌根苗。
23、其次，本专利技术通过一级平板接种，二级液体发酵培养和制备菌丝体胶丸，三级固体基质扩繁，制备的外生菌根真菌菌剂，操作方便、成本低廉、简单高效，有利于菌根合成及菌根苗的培育；
24、然后，本专利技术通过简单的混合方法制备了菌丝体胶丸，菌丝体胶丸直径约2.5 mm，内有大量完整的菌丝，单个菌丝体胶丸就足以形成菌根，最多可保存6个月仍具有活力；
25、最后，本专利技术通过此菌剂的接种，可实现云南硬皮马勃的单一侵染，菌根侵染率可达到90%以上，同时可提高松树幼苗的抗病性和生长。
26、大多数外生菌根真菌传代数次后就会老化或退化，但是通过发酵获得菌丝体，不仅培养时间短，育苗速度快，尤其是本专利涉及的菌丝体胶丸，允许真菌菌丝在这些胶丸内生长，以便在施用前使菌丝片段生长恢复为菌丝体，是更有效的繁殖体，可帮助获得更高质量的菌根苗，同时可提高松树幼苗的抗病性和生长，且利于保存，时效较长，可长达数月，便于工业化的生产、推广和应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种外生菌根真菌云南硬皮马勃ZSS01菌株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO:M 2023594。
2.一种菌剂，其特征在于，含保藏编号为CCTCC NO:M 2023594的云南硬皮马勃ZSS01菌株液体培养后获得的菌丝体发酵液。
3.根据权利要求2所述的菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的菌剂制备方法，其特征在于，所述改良PDA固体培养基配方为：马铃薯200g，琼脂18.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，维生素B1 10mg，NH4NO3 0.25 g，pH5.7±0.1，蒸馏水1000 mL。
5.根据权利要求3所述的菌剂制备方法，其特征在于，扩大培养的条件如下：培养温度25℃，pH 5.7±0.1，150 r·min-1摇床培养14 d。
6.一种菌丝体胶丸，其特征在于，所述菌丝体胶丸含有权利要求1所述云南硬皮马勃ZSS01菌株的菌丝体。
7.根据权利
8.根据权利要求7所述的菌丝体胶丸的制备方法，其特征在于，海藻酸钠溶液浓度为2%~4%，悬浊液和海藻酸钠溶液的体积比为1:50，CaCl2溶液的浓度为0.15~0.25 mol/L。
9.一种外生菌根真菌三级菌种的制备方法，其特征在于，包括以下步骤
10.权利要求1所述的云南硬皮马勃ZSS01菌株、权利要求2所述的菌剂、权利要求6所述的菌丝体胶丸或权利要求9所述制备方法获得的云南硬皮马勃ZSS01三级菌种接种至松树苗木形成外生菌根中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种外生菌根真菌云南硬皮马勃zss01菌株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏编号为cctcc no:m 2023594。
2.一种菌剂，其特征在于，含保藏编号为cctcc no:m 2023594的云南硬皮马勃zss01菌株液体培养后获得的菌丝体发酵液。
3.根据权利要求2所述的菌剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的菌剂制备方法，其特征在于，所述改良pda固体培养基配方为：马铃薯200g，琼脂18.0 g，葡萄糖20.0 g，kh2po4 3.0 g，mgso4·7h2o 1.5 g，维生素b1 10mg，nh4no3 0.25 g，ph5.7±0.1，蒸馏水1000 ml。
5.根据权利要求3所述的菌剂制备方法，其特征在于，扩大培养的条...
【专利技术属性】
技术研发人员：张珊珊，杨文忠，陈剑，张传光，
申请(专利权)人：云南省林业和草原科学院，
类型：发明
国别省市：
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